Key Difference – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
DNA-sekvensering är mycket viktig för DNA-analys eftersom kunskap om det korrekta nukleotidarrangemanget på en viss DNA-region avslöjar många viktig information om den. Det finns olika DNA-sekvenseringsmetoder. Sanger-sekvensering och Pyrosequencing är två olika DNA-sekvenseringsmetoder som ofta används inom molekylärbiologi. Den viktigaste skillnaden mellan Sanger-sekvensering och Pyrosequencing är att Sanger-sekvensering använder dideoxinukleotider för att avsluta syntesen av DNA för att läsa nukleotidsekvensen medan pyrosekvensering detekterar pyrofosfatfrisättningen genom att införliva nukleotiderna och syntetisera den kompletterande sekvensen för att läsa den kompletterande sekvensen.
Vad är Sanger Sequencing?
Sanger-sekvensering är en första generationens DNA-sekvenseringsmetod utvecklad av Frederick Sanger och hans högskolor 1977. Den är också känd som Chain Termination Sequencing eller Dideoxy-sekvensering eftersom den är baserad på kedjeterminering av dideoxinukleotider (ddNTP). Denna metod användes allmänt i mer än 30 år tills New Generation Sequencing (NGS) utvecklades. Sanger-sekvenseringstekniken möjliggjorde upptäckten av den korrekta nukleotidordningen eller fästningen av ett visst DNA-fragment. Den är baserad på selektiv inkorporering av ddNTP:er och avbrytande av DNA-syntes under in vitro-DNA-replikationen. Frånvaron av 3' OH-grupper för att fortsätta fosfodiesterbindningsbildningen mellan intilliggande nukleotider är en unik egenskap hos ddNTP. Så snart ddNTP är fäst, upphör kedjeförlängningen och slutar från den punkten. Det finns fyra ddNTP:er – ddATP, ddCTP, ddGTP och ddTTP – som används i Sanger-sekvensering. Dessa nukleotider stoppar DNA-replikationsprocessen när de införlivas i den växande DNA-strängen och resulterar i varierande längder av kort DNA. Kapillärgelelektrofores används för att organisera dessa korta DNA-strängar efter deras storlekar på en gel som visas i figur 01.
Figur 1: Kapillärgelelektrofores av syntetiserat kort DNA
För in vitro-replikation av DNA bör få krav ställas. De är DNA-polymerasenzym, mall-DNA, oligonukleotidprimrar och deoxinukleotider (dNTP). Vid Sanger-sekvensering utförs DNA-replikation i fyra separata provrör tillsammans med fyra typer av ddNTP separat. Deoxinukleotider är inte helt ersatta av respektive ddNTP. En blandning av den särskilda dNTP (till exempel dATP + ddATP) ingår i röret och replikeras. Fyra separata rörprodukter körs på en gel i fyra separata brunnar. Genom att sedan läsa gelén kan sekvensen konstrueras som visas i figur 02.
Figur 02: Sanger-sekvensering
Sanger-sekvensering är en viktig teknik som hjälper till inom många områden av molekylärbiologin. Det mänskliga genomprojektet slutfördes framgångsrikt med hjälp av Sanger-sekvenseringsbaserade metoder. Sanger-sekvensering är också användbar vid mål-DNA-sekvensering, cancer och genetisk sjukdomsforskning, genuttrycksanalys, mänsklig identifiering, patogendetektion, mikrobiell sekvensering etc.
Det finns flera nackdelar med Sanger-sekvensering:
- Längden på det DNA som sekvenseras får inte vara längre än 1000 baspar
- Endast en sträng kan sekvenseras åt gången.
- Processen är tidskrävande och dyr.
Därför utvecklades nya avancerade sekvenseringstekniker med tiden för att övervinna dessa problem. Sanger-sekvensering används dock fortfarande på grund av dess mycket exakta resultat upp till cirka 850 basparlängdsfragment.
Vad är Pyrosequencing?
Pyrosequencing är en ny DNA-sekvenseringsteknik baserad på "sekvensering genom syntes". Denna teknik bygger på detektering av pyrofosfatfrisättning vid nukleotidinkorporering. Processen används av fyra olika enzymer: DNA-polymers, ATP-sulfurylas, luciferas och apyras och två substrat adenosin 5' fosfosulfat (APS) och luciferin.
Processen börjar med att primern binder till den enkelsträngade DNA-mallen och DNA-polymeras startar inkorporeringen av nukleotider som är komplementära till den. När nukleotiderna går samman (nukleinsyrapolymerisation) frigörs pyrofosfatgrupper (två fosfatgrupper bundna tillsammans) och energi. Varje nukleotidtillsats frisätter ekvimolär mängd pyrofosfat. Pyrofosfat omvandlas till ATP genom ATP-sulfurylas i närvaro av substrat APS. Den genererade ATP driver den luciferasmedierade omvandlingen av luciferin till oxyluciferin, och producerar synligt ljus i mängder som är proportionella mot mängden ATP. Ljus detekteras av en fotondetektionsanordning eller av fotomultiplikator och skapar ett pyrogram. Apyras bryter ned ATP och icke-inkorporerade dNTP i reaktionsblandningen. dNTP-tillägg görs en gång i taget. Eftersom tillsatsen av nukleotid är känd i enlighet med införlivandet och detekteringen av ljus, kan sekvensen för mallen bestämmas. Pyrogram används för att generera nukleotidsekvensen för prov-DNA:t som visas i figur 03.
Pyrosequencing är mycket viktigt vid analys av enkelnukleotidpolymorfism och sekvensering av korta DNA-sträckor. Den höga noggrannheten, flexibiliteten, enkla automatiseringen och parallell bearbetning är fördelarna med pyrosekvensering framför Sangers sekvenseringstekniker.
Figur 03: Pyrosequencing
Vad är skillnaden mellan Sanger Sequencing och Pyrosequencing?
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Sanger-sekvensering är en DNA-sekvenseringsmetod baserad på selektiv inkorporering av ddNTP genom DNA-polymeras och kedjeterminering. | Pyrosequencing är en DNA-sekvenseringsmetod baserad på detektion av pyrofosfatfrisättning vid inkorporering av nukleotid. |
| Användning av ddNTP | |
| ddNTPs används för att avsluta DNA-replikationen | ddNTP:er används inte. |
| Enzymer involverade | |
| DNA-polymeras används. | Fyra enzymer används: DNA-polymeras, ATP-sulfurylas, Luciferase och Apyras. |
| Använda substrat | |
| APS och Luciferin används inte. | Adenosine 5’ phosphosulfate (APS) och luciferin används. |
| Maximal temperatur | |
| Detta är en långsam process. | Detta är en snabb process. |
Sammanfattning – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger-sekvensering och Pyrosequencing är två DNA-sekvenseringsmetoder som används inom molekylärbiologi. Sanger-sekvensering konstruerar ordningen för nukleotiderna i sekvens genom att avsluta kedjeförlängningen medan pyrosekvenseringen konstruerar den exakta ordningen av nukleotiderna i sekvens genom att införliva nukleotider och detektera frisättningen av pyrofosfater. Därför är den största skillnaden mellan Sanger-sekvensering och Pyrosequencing att Sanger-sekvensering fungerar på sekvensering genom kedjeavslutning medan pyrosequencing fungerar på sekvensering genom syntes.
