Key Difference – NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) och Sanger Sequencing är två typer av nukleotidsekvenseringstekniker som utvecklats under tiden. Sanger Sequencing-metoden användes flitigt i många år och NGS ersatte den nyligen på grund av dess fördelar. Den viktigaste skillnaden mellan NGS och Sanger Sequencing är att NGS fungerar på principen att sekvensera miljontals sekvenser samtidigt på ett snabbt sätt genom ett sekvenseringssystem medan Sanger Sequencing fungerar på principen om kedjeterminering på grund av selektiv inkorporering av dideoxinukleotider av DNA-polymerasenzym under DNA-replikationen och resulterande fragmentseparation genom kapillärelektrofores.
Vad är nukleotidsekvensering?
Genetisk information lagras i nukleotidsekvenserna för en organisms DNA eller RNA. Processen att bestämma den korrekta ordningen av nukleotider (med hjälp av fyra baser) i ett givet fragment (i en gen, ett kluster av gener, kromosom och fullständigt genom) är känd som nukleotidsekvensering. Det är mycket viktigt inom genomstudier, krimin altekniska studier, virologi, biologisk systematik, medicinsk diagnostik, bioteknik och inom många andra områden att analysera geners struktur och funktion. Det finns olika typer av sekvenseringsmetoder som utvecklats av forskare. Bland dem användes Sanger-sekvensering som utvecklades av Frederick Sanger 1977 i stor utsträckning och blev populär under en lång tidsperiod tills Next Generation Sequencing ersatte den.
Vad är NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) är en term som används för att hänvisa till moderna sekvenseringsprocesser med hög genomströmning. Den beskriver ett antal olika moderna sekvenseringsteknologier som revolutionerade genomiska studier och molekylärbiologi. Dessa tekniker är Illumina-sekvensering, Roche 454-sekvensering, jonprotonsekvensering och SOLiD-sekvensering (Sequencing by Oligo Ligation Detection). NGS-system är snabbare och billigare. Fyra huvudsakliga DNA-sekvenseringsmetoder används i NGS-system, nämligen; pyrosekvensering, sekvensering genom syntes, sekvensering genom ligering och jonhalvledarsekvensering. Ett stort antal DNA- eller RNA-strängar (miljontals) kan sekvenseras parallellt. Det tillåter sekvensering av hela genomet av organismer inom en kort tidsperiod, till skillnad från Sanger-sekvensering som tar längre tid.
NGS har många fördelar jämfört med konventionell Sanger-metoden. Det är en höghastighets, mer exakt och kostnadseffektiv process som kan utföras med en liten provstorlek. NGS kan användas i metagenomiska studier, vid detektion av variationer inom ett enskilt genom på grund av insertioner och deletioner etc. och i analys av genuttryck.
Figure_1: Utveckling av NGS-sekvensering
Vad är Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing är en sekvenseringsmetod utvecklad av Frederick Sanger och hans kollegor 1977 för att bestämma den exakta nukleotidordningen för ett givet DNA-fragment. Det är också känt som kedjeavslutningssekvensering eller dideoxisekvensering. Arbetsprincipen för denna metod är terminering av strängsyntes genom selektiv inkorporering av en kedjeterminerande dideoxinukleotider (ddNTP) såsom ddGTP, ddCTP, ddATP och ddTTP genom DNA-polymeras under replikeringen av DNA. Normala nukleotider har 3' OH-grupper för bildandet av en fosfodiesterbindning mellan intilliggande nukleotider för att fortsätta strängbildningen. Emellertid saknar ddNTP denna 3' OH-grupp och kan inte bilda fosfodiesterbindningar mellan nukleotider. Därför upphör kedjeförlängningen.
I denna metod fungerar det enkelsträngade DNA som ska sekvenseras som mallsträng för in vitro DNA-syntes. Andra krav är oligonukleotidprimer, deoxinukleotidprekursorer och DNA-polymerasenzym. När de flankerande ändarna av målfragmentet är kända kan primrar enkelt utformas för DNA-replikation. Fyra separata DNA-syntesreaktioner utförs i fyra separata rör. Varje tub har separata ddNTP, tillsammans med andra krav. Från den specifika nukleotiden tillsätts en blandning av dNTP och ddNTP. På samma sätt utförs fyra separata reaktioner i fyra rör med fyra blandningar. Efter reaktionerna utförs detektering av DNA-fragment och omvandling av fragmentmönstret till sekvensinformation. Resulterande DNA-fragment värmedenatureras och separeras genom gelelektrofores. Om radioaktiva nukleotider används kan bandmönstret i polyakrylamidgelen visualiseras med autoradiografi. När denna metod använder de fluorescerande märkta dideoxinukleotiderna, kan den dämpas ner genom gelavläsningen och passera genom en laserstråle för att detekteras av den fluorescerande detektorn. För att undvika fel som kan uppstå när en sekvens läses av ögat och matas in manuellt i en dator, utvecklades denna metod till att använda en automatisk sekvenser kopplad till datorn.
Det här är metoden som används för att sekvensera DNA från Human Genome-projektet. Denna metod används fortfarande med avancerade modifieringar eftersom den ger korrekt sekvensinformation trots att det är en dyr och långsam process.
Figure_2: Sanger Sequencing
Vad är skillnaden mellan NGS och Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) hänvisar till moderna sekvenseringsprocesser med hög genomströmning. Den beskriver ett antal olika moderna sekvenseringstekniker | Sanger Sequencing är en sekvenseringsmetod utvecklad av Frederick Sanger för att bestämma den exakta nukleotidordningen för ett givet DNA-fragment. |
| Kostnadseffektivitet | |
| NGS är en billigare process eftersom den minskar tid, arbetskraft och kemikalier. | Det här är en kostsam process eftersom det tar tid, arbetskraft och mer kemikalier. |
| Speed | |
| Detta går snabbare eftersom både kemisk detektering och signaldetektering av många trådar sker parallellt. | Detta är tidskrävande eftersom kemisk detektering och signaldetektering sker som två separata processer och endast på sträng kan läsa åt gången. |
| Reliability | |
| NGS är pålitligt. | Sanger-sekvensering är mindre tillförlitlig |
| Provstorlek | |
| NGS kräver mindre mängd DNA. | Denna metod kräver en stor mängd mall-DNA. |
| DNA-baser per sekvenserat fragment | |
| Antalet DNA-baser per sekvenserat fragment är lägre än Sanger-metoden | Genererande sekvenser är längre än NGS-sekvenser. |
Sammanfattning – NGS vs Sanger Sequencing
NGS och Sanger Sequencing är nukleotidsekvenseringstekniker som används flitigt inom molekylärbiologi. Sanger-sekvensering är en tidig sekvenseringsmetod som ersattes av NGS. Den största skillnaden mellan NGS och Sanger Sequencing är att NGS är en höghastighets, mer exakt och kostnadseffektiv process än Sanger-sekvensering. Båda teknikerna skapade stora utbrott inom genetik och bioteknik.
