Nyckelskillnaden mellan klon för klon-sekvensering och hagelgevärssekvensering ligger i deras uppförandemetod. Klon-för-klon-sekvenseringsmetod innebär kartläggning av kromosomer och kloning före sekvensering, medan klon med hagelgevärssekvensering utelämnar både kromosomkartläggning och kloningssteg under sekvenseringen.
Klon för klonsekvensering och klon med hagelgevärssekvensering är två metoder för modern genomsekvensering. Klon för klon sekvensering är en mer tillförlitlig metod för sekvensering. Metoden att klona genom hagelgevärssekvensering är dock snabbare och billigare. Artikeln fokuserar på den subtila skillnaden mellan klon för klon-sekvensering och hagelgevärssekvensering.
Vad är Clone by Clone Sequencing?
Klon för klon-sekvensering är en metod för genomsekvensering. Det kräver kartläggning av varje kromosom innan DNA-delning. Efter kartläggning ska DNA:t brytas ner till fragment på 150 kilobaser långa. Dessa fragment är sedan redo för sekvensering. Nästa steg är införandet av DNA-fragment i bakteriella artificiella kromosomer (BAC) och sedan i bakterieceller. Eftersom fragmenten nu finns inne i bakteriecellerna delar sig de insatta DNA-fragmenten varje gång bakterierna delar sig och producerar många identiska kopior. Sedan fragmenteras det individuella bakteriella klon-DNA:t till 500 baspar långa fragment. De är mindre och överlappande fragment. Därefter sker sekvenseringen med infogning av dessa fragment i en vektor med en känd DNA-sekvens. Utgående från den kända sekvensen för vektorn fortsätter sekvenseringen upp till okänd sekvens.
När du har avslutat sekvenseringen är det nödvändigt att identifiera områden med överlappande sekvenser. Därefter sker sammanfogning av fragmenten för att bilda de större fragmenten som initi alt presenterades i BAC. Därefter sker sammansättningen av större fragment till kromosomen enligt genomkartan.
Figur 01: Clone by Clone Sequencing
Den betydande fördelen med klon-för-klon-sekvensering är att den förberedda genomkartan hjälper en tillförlitlig sammansättning av större fragment. Men, nackdelen med denna sekvenseringsmetod är att det är tidskrävande att generera genomkartor och göra kloner. Detta var dock den metod som föredrogs under 'Human Genome Project'.
Vad är Clone by Shotgun Sequencing?
Clone by shotgun-sekvensering är en sekvenseringsmetod som slumpmässigt bryter upp DNA-sekvenser i många små fragment och sätter ihop sekvensen igen genom att observera de överlappande regionerna. Större däggdjursgenom är svåra att klona och sätta ihop. Det beror på deras strukturella komplexitet och storlek. Även om klon för klon-sekvenseringsmetoden är tillförlitlig tar det lång tid att sekvensera genom från komplexa organismer. Därför har klon med hagelgevär-sekvensering blivit en pålitlig billigare sekvenseringsmetod som kan utföras snabbare. Därför förlitar sig nutida forskare på denna sekvenseringsmetod för att hantera komplexa genom.
Figur 02: Clone by Shotgun Sequencing
Under sekvenseringsmetoden för kloning med hagelgevär sker inga konventionella genomkartläggningar och kloningssteg. Inledningsvis fragmenteras hela genomet i varierande storlekar från 20 kilobaser till 300 kilobaser. Därefter sker sekvensering. Sedan, med hjälp av sofistikerad datorprogramvara, är det nödvändigt att sätta ihop fragmenten genom att titta på de överlappande områdena.
Klonning med hagelgevärssekvensering hjälper till att förbättra noggrannheten hos befintliga genomsekvenser. Den största fördelen med denna metod är att den är mycket snabbare och billigare än klon för klon sekvenseringsmetod. Denna process involverar dock inte användningen av en genetisk karta. Därför är det mer sannolikt att fel under monteringen uppstår. Detta är alltså en stor nackdel vid sekvensering av kloning med hagelgevär.
Vilka är likheterna mellan Clone by Clone Sequencing och Shotgun Sequencing?
- Både klon för klon-sekvensering och hagelgevärssekvensering är två metoder för genomsekvensering.
- Under båda sekvenseringsteknikerna sker sammansättning av nedbrutna fragment genom att identifiera överlappande regioner.
- Dessutom är nedbrytning av DNA till mindre fragment nödvändig för både klon- och hagelgevärssekvensering.
Vad är skillnaden mellan Clone by Clone Sequencing och Shotgun Sequencing?
Klon för klon-sekvenseringsteknik involverar två huvudsteg: kartläggning av kromosomer och kloning. Däremot följer inte sekvensering av klon genom hagelgevär dessa två steg; den bryter slumpmässigt upp DNA-sekvenser i många små fragment och sätter ihop sekvensen igen genom att observera de överlappande regionerna. Därför är detta nyckelskillnaden mellan klon för klon-sekvensering och hagelgevärssekvensering. På grund av denna faktor är sekvensering av klon för klon en dyr och tidskrävande process medan sekvensering av klon med hagelgevär är snabbare och billigare.
Fel under montering är dock mindre sannolikt att uppstå under klon-för-klon-sekvensering. Därför har den hög tillförlitlighet. Klon genom hagelgevärssekvensering är dock en jämförelsevis mindre tillförlitlig teknik. Så detta är också en betydande skillnad mellan klon för klon sekvensering och hagelgevär sekvensering.
Informationsgrafiken nedan visar mer information om skillnaden mellan klon för klon-sekvensering och hagelgevärssekvensering.
Sammanfattning – Clone by Clone Sequencing vs Shotgun Sequencing
För att sammanfatta skillnaden mellan klon för klon-sekvensering och hagelgevärssekvensering, är klon för klon-sekvensering och hagelgevärssekvensering två metoder för genomsekvensering. Emellertid involverar klon för klon sekvenseringsteknik både genomkartläggning och kloningsprocesser medan klon med hagelgevärssekvensering inte gör det. Så detta är nyckelskillnaden mellan klon för klon-sekvensering och hagelgevärssekvensering. Eftersom genomkartläggning sker under klon-för-klon-sekvensering, är det mindre sannolikt att fel uppstår under sammansättningen av sekvenser. Men sekvensering av klon med hagelgevär är en mycket snabbare och billigare process. Ändå är den jämförelsevis mindre tillförlitlig. Klon för klon-sekvensering var den föredragna sekvenseringsmetoden under "Human Genome Project". Men den moderna molekylärbiologen förlitar sig mer på klon genom hagelgevärssekvensering.
