Key Difference – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotider är de grundläggande strukturella enheterna och byggstenarna i DNA. DNA-molekylen är sammansatt av en polynukleotidkedja. Det finns fyra olika nukleotider som finns i DNA. Dessa nukleotider är sammansatta av fyra olika kväveh altiga baser som heter A (adenin), G (guanin), C (cytosin), T (tymin). Nukleotidernas ordning i DNA-molekylen har stor betydelse eftersom den kodar för en viktig genetisk information för organismers tillväxt och utveckling. DNA-sekvensering avser den process som bestämmer den exakta nukleotidsekvensen för DNA:t. Det finns olika DNA-sekvenseringsmetoder. Maxam Gilbert-sekvensering och Sanger DNA-sekvensering är två metoder för DNA-sekvensering som tillhör första generationens sekvensering. Maxam Gilbert sekvenseringsprocedur bestämmer bassekvensen genom att kemiskt klyva de 5'-ändsmärkta DNA-fragmenten företrädesvis vid var och en av fyra nukleotider och gelelektrofores. Sanger-sekvenseringsproceduren bestämmer nukleotidsekvensen genom att syntetisera enkelsträngat DNA med hjälp av DNA-polymeras och dideoxinukleotider och gelelektrofores. Detta är den viktigaste skillnaden mellan Maxam Gilbert och Sanger Sequencing.
Vad är Maxam Gilbert Sequencing?
Maxam Gilbert-sekvensering, även känd som kemisk sekvenseringsmetod, är en teknik som utvecklades för att bestämma ordningen på nukleotiderna i DNA. Denna metod introducerades av W alter Gilbert och Alan Maxam 1976 och blev populär eftersom den kan utföras direkt med renat DNA. Maxam Gilbert-metoden tillhör den första generationen av DNA-sekvensering, och det var den första sekvenseringsmetoden som användes allmänt av forskare.
Grundprincipen för denna metod ligger i begränsningen av de ändmärkta DNA-fragmenten vid specifika baser genom basspecifika kemikalier och betingelser och separation av de märkta fragmenten genom elektrofores som visas i figur 01. Fragment separeras enligt till deras storlekar på gelén. Eftersom fragmenten är märkta kan sekvensen för DNA-molekylen lätt härledas.
Maxam gilbert-metoden använder basspecifika kemikalier för att bryta DNA vid specifika baser. Två vanliga kemikalier som heter dimetylsulfat och hydrazinkemikalier används för att selektivt attackera puriner respektive pyrimidiner.
Maxam Gilberts sekvenseringsmetod utförs via flera steg enligt följande.
- Rening av DNA-sekvensen med användning av restriktionsendonukleaser
- Märkning av ändarna av DNA-fragmenten genom att tillsätta radioaktiva fosfater
- Rening av de märkta fragmenten från omärkta fragment genom gelelektrofores
- Separation av det ändmärkta DNA:t i fyra rör och behandling med basspecifika kemikalier separat
- Elektrofores av innehållet i varje rör på separata linjer på en gel och fragmentseparation enligt deras längd.
- Detektering av fragmenten med autoradiograf.
Figur 01: Maxam Gilbert Sequencing
Vad är Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing är en sekvenseringsmetod utvecklad av Frederick Sanger och hans kollegor 1977 för att bestämma bassekvensen för ett givet DNA-fragment. Det är också känt som kedjeavslutningssekvensering eller Dideoxy-sekvenseringsmetod. Denna metod fungerar på principen om selektiv inkorporering av kedjeterminerande dideoxinukleotider (ddNTP) såsom ddGTP, ddCTP, ddATP och ddTTP genom DNA-polymeras under syntesen av enkelsträngat DNA för att avsluta strängbildning. Dideoxinukleotider saknar 3' OH-grupper för bildning av fosfodiesterbindningar med intilliggande nukleotid. Följaktligen stannar strängbildningen när en ddNTP införlivas i nybildande sträng under sanger-sekvensering.
I denna metod utförs fyra separata DNA-syntesreaktioner (PCR) i fyra separata rör med en typ av ddNTP. Andra krav ställs också för rören för PCR inklusive primers, dNTPs, Taq-polymeras, specifika förhållanden etc. Fyra separata reaktioner utförs i fyra rör med fyra blandningar. Efter PCR-reaktioner värmedenatureras resulterande DNA-fragment och separeras genom gelelektrofores. Sedan visualiseras fragmenten genom att använda antingen en märkt (radioaktiv eller fluorescerande) primer eller dNTPs som visas i figur 02.
Figur 02: Sanger Sequencing
Vad är skillnaden mellan Maxam Gilbert och Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert-sekvensering är den första tekniken som utvecklats för DNA-sekvensering. | Sanger-sekvenseringsmetoden introducerades efter Maxam Gilbert-sekvenseringsmetoden. |
| Användning | |
| Denna metod används sällan. | Sanger-sekvensering används rutinmässigt för sekvensering. |
| Användning av farliga kemikalier | |
| Den använder farliga kemikalier. | Användning av farliga kemikalier är begränsad jämfört med Maxam Gilbert-metoden. |
| Labeling for detection | |
| Denna metod använder radioaktivt P32 för att märka ändarna av DNA-fragmenten. | Sanger-sekvensering använder radioaktivt eller fluorescerande märkta ddNTPs. |
Sammanfattning – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert och Sanger-sekvensering är två typer av DNA-sekvenseringstekniker som ingår i första generationens DNA-sekvensering. Maxam Gilbert-sekvensering är den första metoden som introducerades för DNA-sekvensering 1976, och den utförs genom att bryta de ändmärkta DNA-fragmenten med basspecifika kemikalier. Därför är det känt som kemisk sekvensering. Sanger-sekvenseringsmetoden introducerades 1977 och är baserad på ddNTP-drivna kedjereaktioner. Sanger-sekvenseringsmetoden populär än Maxam Gilbert-metoden på grund av flera nackdelar med Maxam Gilbert-metoden såsom överdriven tidsåtgång, användning av farliga kemikalier, etc. Det här är skillnaden mellan Maxam Gilbert och Sanger-sekvensering.
