nyckelskillnad – PCR vs DNA-sekvensering
PCR och DNA-sekvensering är två viktiga tekniker inom molekylärbiologi. Polymeraskedjereaktion (PCR) är den process som skapar ett stort antal kopior av ett DNA-fragment. DNA-sekvensering är den teknik som resulterar i den exakta ordningen av nukleotiderna i ett givet DNA-fragment. Detta är nyckelskillnaden mellan PCR och DNA-sekvensering. PCR är ett av de viktigaste stegen i DNA-sekvensering.
Vad är PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) är en DNA-amplifieringsteknik som används inom molekylärbiologi. Den producerar tusentals till miljontals kopior av ett visst DNA-fragment. Denna metod utvecklades av Kary Mullis 1983. I denna teknik tjänar fragmentet av DNA som ska amplifieras som mall och DNA-polymerasenzymet lägger till komplementära nukleotider till primern som är tillgänglig i PCR-blandningen. I slutet av PCR-reaktionen syntetiseras många kopior av provets DNA.
Det finns olika komponenter i PCR-blandningen, inklusive DNA, DNA-polymeras (Taq-polymeras), primers (framåtriktade och omvända primers), nukleotider (byggstenar av DNA) och en buffert. PCR sker inuti en PCR-maskin, och rätt PCR-blandning bör laddas in i maskinen, och rätt program bör köras. Denna teknik möjliggör produktion av tusentals till miljontals kopior av en viss del av DNA från en mycket liten mängd DNA.
PCR-reaktioner sker på ett cykliskt sätt för att producera den synliga mängden PCR-produkter på en gel. Det finns tre huvudsteg involverade i en PCR-reaktion, nämligen denaturering, primer-annealing och strängförlängning som visas i figur 01. Dessa tre steg sker vid tre olika temperaturer. DNA existerar i dubbelsträngad form genom vätebindningar mellan de komplementära baserna. Före implikation bör dubbelsträngat DNA separeras från varandra. Det görs genom att ge en hög temperatur. Vid hög temperatur denaturerar dubbelsträngat DNA till enkelsträngar. Sedan bör primrarna komma närmare de flankerande ändarna av det specifika fragmentet eller genen av DNA. Primer är en kort bit enkelsträngat DNA som är komplementär till målsekvensen. Framåt- och bakåtprimrar hybridiserar med de komplementära baserna vid de flankerande ändarna av det denaturerade provets DNA vid hybridiseringstemperaturen. Primers bör vara värmebeständiga. När primers hybridiseras med prov-DNA, initierar taq-polymerasenzymet syntesen av de nya strängarna genom att lägga till nukleotider som är komplementära till mål-DNA:t. Taq-polymeras är ett värmestabilt enzym isolerat från en termofil bakterie som kallas Thermus aquaticus. PCR-buffert upprätthåller de optimala förhållandena för taq-polymerasverkan. Dessa tre steg av PCR-reaktioner upprepas för att producera den erforderliga mängden PCR-produkt. Efter varje PCR-reaktion fördubblas antalet DNA-kopior. Därför kan en exponentiell amplifiering observeras i PCR. PCR-produkter kan observeras med gelelektrofores och kan renas för ytterligare studier.
Figur 01: Huvudstegen i en PCR-reaktion
PCR är ett värdefullt verktyg inom medicinsk och biologisk forskning. PCR har ett speciellt värde inom krimin altekniken eftersom det kan förstärka DNA för studier från de små proverna från brottslingarna och göra krimin altekniska DNA-profiler. PCR används i stor utsträckning inom många områden av molekylärbiologi, inklusive genotypning, genkloning, mutationsdetektion, DNA-sekvensering, DNA-mikroarrayer och faderskapstestning, etc.
Figur 02: Polymeraskedjereaktion
Vad är DNA-sekvensering?
DNA-sekvensering är bestämningen av en exakt ordning av nukleotiderna – adenin, guanin, cytosin och tymin i ett givet DNA-fragment. Genetisk information lagras i DNA-sekvenserna med hjälp av rätt ordning på nukleotiderna. Att hitta den exakta ordningen för nukleotiderna i ett DNA-fragment är därför mycket viktigt att veta om genernas struktur och funktion.
DNA-sekvenseringsprotokoll involverar olika processer. Det första steget är isoleringen av intresserad DNA eller genomiskt DNA från en organism. Med användning av PCR (som beskrivits ovan) bör den önskade regionen av DNA:t amplifieras. Amplifierad PCR-produkt bör separeras med gelelektrofores och renas. Amplifierade fragment tjänas som mallar för sekvensering. Sekvensering kan göras antingen efter Sanger-sekvensering eller sekvensering med hög genomströmning. Sanger-sekvensering kräver kapillärelektrofores av resulterande DNA-fragment. Bestämning av den korrekta nukleotidordningen kan göras genom manuell avläsning av autoradiografier eller genom att använda automatiska DNA-sekvenserare.
Gensekvensering bidrog till projektet för det mänskliga genomet och underlättade kartläggningen av det mänskliga genomet 2003. Inom krimin altekniken möjliggjorde DNA-sekvensering identifiering av individer som visar unika DNA-sekvenser och identifierar brottslingarna. Inom medicin kan DNA-sekvensering användas för att upptäcka de gener som är ansvariga för genetiska och andra sjukdomar, hitta defekta gener och ersätta dem med korrekta gener. Inom jordbruket används DNA-sekvenseringsinformation för vissa mikroorganismer för att producera transgena grödor med ekonomiskt önskvärda egenskaper.
Figur 03: DNA-sekvensering
Vad är skillnaden mellan PCR och DNA-sekvensering?
PCR vs DNA-sekvensering |
|
| PCR-processen skapar tusentals till miljontals kopior av det intresserade DNA-fragmentet. | DNA-sekvensering är processen för att bestämma den exakta ordningen för nukleotiderna i ett givet DNA-fragment. |
| Utfall | |
| PCR skapar tusentals till miljontals kopior av ett visst DNA-fragment | Detta resulterar i rätt ordning av baserna i ett visst DNA-fragment. |
| Involvering av ddNTPs | |
| PCR kräver inte ddNTP. Den använder dNTP. | DNA-sekvensering kräver ddNTP för att avsluta strängbildning. |
Sammanfattning – PCR vs DNA-sekvensering
PCR och DNA-sekvensering är mycket viktiga verktyg inom många områden av molekylärbiologi. Amplifiering av DNA-fragmenten görs med PCR-tekniken medan den korrekta ordningen för nukleotiderna i ett DNA-fragment bestäms av DNA-sekvenseringen. Detta är skillnaden mellan PCR och DNA-sekvensering.
