Nyckelskillnad – RT PCR vs QPCR
Polymerase Chain Reaction är en teknik som används för att amplifiera en specifik region av DNA in vitro. På grund av uppfinningen av denna teknik av Kary Mullis 1983, kan forskare göra tusen till miljoner kopior av specifika DNA-fragment för forskningsändamål. För närvarande har det blivit en vanlig och rutinmässigt utförd teknik i kliniska och forskningslaboratorier för en mängd olika tillämpningar. Det finns variationer av traditionell PCR-teknik som RT PCR, kapslad PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR, etc. RT PCR och Q PCR är två viktiga varianter av PCR. Den viktigaste skillnaden mellan RT PCR och Q PCR är att RT PCR används för att detektera genuttryck genom att skapa komplementära DNA (cDNA) transkript från RNA medan Q PCR används för att kvantitativt mäta PCR-produkterna i re altid med fluorescerande färgämnen.
Vad är RT PCR?
Omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (RT PCR) är en variant av PCR som används för att detektera RNA-uttryck. Det är en mycket viktig metod för att detektera mRNA-uttryck i vävnader. RT PCR används när utgångsmaterialet för provet är RNA. I RT PCR omvandlas mallen mRNA först till komplementärt DNA. Detta steg katalyseras av enzymet omvänt transkriptas och processen är känd som omvänd transkription. För det andra används traditionell PCR för det nysyntetiserade cDNA:t för amplifieringen.
RT PCR är en mycket känslig teknik som kräver en relativt liten mängd RNA-prov. RT PCR används ofta vid diagnos och kvantifiering av RNA-arter, särskilt RNA-virus som humant immunbristvirus och hepatit C-virus.
Figur 01: RT PCR-teknik
Vad är QPCR?
Quantitative PCR (QPCR) är en variant av PCR som används för att kvantitativt mäta PCR-produkterna. Det kallas också för re altidspolymeraskedjereaktion eftersom det mäter förstärkningen av re altid med en re altids-PCR-maskin. Det är en lämplig metod för att bestämma mängden av en målsekvens eller gen som finns i ett prov. Det intressanta med QPCR är att det kombinerar både amplifiering och sann kvantifiering i ett enda steg. Därför kan behovet av gelelektrofores vid detektion elimineras med QPCR-teknik. QPCR använder fluorescerande färgämnen för att märka PCR-produkter under PCR-reaktionerna som så småningom leder till direkt kvantifiering. När PCR-produkterna ackumuleras ackumuleras även de fluorescerande signalerna och det kommer att mätas av re altidsmaskinen. QPCR kan kombineras med RT PCR. Det är känt som RT – QPCR eller QRT – PCR och anses vara en mycket kraftfull, känslig och kvantitativ metod för att detektera RNA-nivåer i celler eller vävnader.
SYBR Green och Taqman är två metoder som används för att detektera eller titta på förstärkningsprocessen av re altids-PCR. SYBR Green-metoden utförs med ett fluorescerande färgämne som kallas SYBR green och detekterar amplifieringen genom att binda färgen för att producera dubbelsträngat DNA. Taqman utförs med hjälp av dubbelmärkta prober och detekterar amplifieringen genom nedbrytning av sonden med Taq-polymeras och frisättningar av fluoroforen som visas i figur 02. Båda metoderna övervakar amplifieringsprocessens framsteg och rapporterar mängden av produkten i re altid.
PCR i re altid har ett brett utbud av tillämpningar såsom kvantifiering av genuttryck, mikroRNA och icke-kodande RNA-analys, SNP-genotypning, detektion av kopienummervarianter, detektion av sällsynta mutationer, detektion av genetiskt modifierade organismer, detektion av smittämnen, etc.
Figur 02: Kvantitativ PCR-teknik
Vad är skillnaden mellan RT PCR och QPCR?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR är en teknik som används för att detektera genuttryck genom amplifiering. | QPCR är en teknik som amplifierar DNA och kvantifierar PCR-produkterna i re altid. |
| Involvering av omvänt transkriptasenzym | |
| Enzym omvänt transkriptas används för RT PCR. | Enzym omvänt transkriptas används inte för QPCR. |
| Användning av fluorescerande märkta molekyler | |
| Fluorescensmärkta färgämnen eller prober används inte för RT PCR. | Fluorescensmärkta färgämnen eller prober används för QPCR. |
| Kvantifiering av PCR-produkt | |
| Om den inte är kopplad till QPCR, kvantifierar RT PCR inte PCR-produkten. | QPCR mäta PCR-produkten kvantitativt. |
| Startmaterial | |
| Utgångsmaterialet är mRNA. | Utgångsmaterialet är DNA. |
| Syntes av cDNA | |
| Komplementärt DNA produceras under RT PCR. | Komplementärt DNA produceras inte under QPCR. |
Sammanfattning – RT PCR vs QPCR
RT PCR och QPCR är två versioner av traditionell PCR. RT PCR-teknik utförs för mRNA-prover och den drivs av omvänd transkription och produktion av cDNA. QPCR används för att kvantifiera PCR-produkter under re altids-PCR-termiska cykler med fluorescerande färgämnen eller märkta prober. I QPCR representeras mängden PCR-produkt av de emitterade fluorescerande signalerna från provet. RT PCR används populärt som en amplifieringsprocess medan QPCR vanligtvis används som en kvantifieringsprocess. Detta är skillnaden mellan RT PCR och QPCR.
