Nyckelskillnaden mellan konventionella kapslade och re altids-PCR-analyser är att konventionell PCR är en teknik utvecklad för att amplifiera specifika sekvenser av DNA och kapslade PCR är en modifiering av konventionell PCR som består av två sekventiella amplifieringsreaktioner, medan verkliga -time PCR är en variant av konventionell PCR som kan kvantifiera den amplifierade produkten.
PCR är en mycket vanlig vetenskaplig teknik som ofta används inom forskning och medicin för att detektera DNA. PCR-tester används för att detektera antigener genom att detektera deras DNA eller RNA. Generellt är vir alt RNA närvarande i kroppen innan antikroppar detekteras eller uppvisar symtom på sjukdomen. Ett PCR-test kan avgöra om någon har viruset tidigt eller inte. För närvarande är PCR standardtestet för att upptäcka COVID-19-sjukdom. Det finns olika typer av PCR-tekniker som re altids-PCR, kapslad PCR, multiplex-PCR, varmstart-PCR och långdistans-PCR, etc.
Vad är konventionella PCR-analyser?
Konventionell PCR-analys är en DNA-amplifieringsteknik in vitro som rutinmässigt utförs i molekylärbiologiska laboratorier. Denna metod möjliggjorde produktion av tusentals till miljontals kopior av ett visst DNA-fragment. Kary Mullis introducerade denna teknik 1980. Denna teknik kräver ett DNA-fragment som kallas mallen för att göra många kopior av det. Taq-polymeras fungerar som DNA-polymerasenzymet och katalyserar syntesen av nya strängar i mallsekvensen.
Primers i PCR-blandningen kommer att fungera som startpunkter för fragmentförlängningarna. Alla ingredienser som är nödvändiga för att göra kopior av DNA ingår i PCR-blandningen. PCR-reaktionen körs i en PCR-maskin, och den bör matas med rätt PCR-blandning och rätt PCR-program. Om reaktionsblandningen och programmet är korrekta kommer det att producera det erforderliga antalet kopior av en viss del av DNA från en mycket liten mängd DNA.
Figur 01: Konventionell PCR-analys
Det finns tre huvudsteg involverade i en PCR-reaktion: denaturering, primer-annealing och strängförlängning. Dessa tre steg sker vid tre olika temperaturer. PCR-buffert upprätthåller de optimala förhållandena för Taq-polymerasverkan. Dessa tre steg av PCR-reaktionen upprepas för att producera den erforderliga mängden av PCR-produkten. Vid varje PCR-reaktion fördubblas antalet DNA-kopior. Därför kan exponentiell amplifiering observeras i PCR. PCR-produkt kan lösas upp med gelelektrofores eftersom den producerar en synlig mängd DNA på en gel, och den kan renas för ytterligare studier såsom sekvensering.
PCR är ett värdefullt verktyg inom medicinsk och biologisk forskning. Särskilt i krimin altekniska studier har PCR ett enormt värde eftersom det kan förstärka DNA för studier från de små proverna av brottslingarna och göra krimin altekniska DNA-profiler. PCR används i stor utsträckning inom många områden av molekylärbiologi, inklusive genotypning, genkloning, mutationsdetektion, DNA-sekvensering, DNA-mikroarrayer och faderskapstestning.
Vad är Nested PCR-analyser?
Nested PCR är en typ av PCR som minskar den ospecifika amplifieringen av DNA. Det finns två på varandra följande PCR eller två sekventiella amplifieringsreaktioner i kapslad PCR-analys. Under den första amplifieringsreaktionen produceras en PCR-produkt. Efter den första reaktionen utförs en andra amplifieringsreaktion på PCR-produkten från den första reaktionen. Därför binder primrar i den andra reaktionsblandningen till den första PCR-produkten och amplifierar den.
Figur 02: Kapslad PCR
Primerpar är olika i varje reaktion. Den icke-specifika bindningen av primrar reduceras i kapslad PCR. Kapslade PCR-analyser är användbara för att öka sensitiviteten och/eller specificiteten. Men kapslad PCR kräver kunskap om den intresserade sekvensen.
Vad är re altids-PCR-analyser?
Re altids-PCR eller kvantitativ PCR (Q PCR) är en modifierad version av PCR som mäter PCR-produkterna kvantitativt. Därför kvantifierar denna teknik amplifieringen i re altid med användning av en re altids-PCR-maskin. Det är också en lämplig metod för att bestämma mängden av en målsekvens eller gen som finns i ett prov.
Det intressanta med re altids-PCR är att den kombinerar både amplifiering och sann kvantifiering i ett enda steg. Därför kan behovet av gelelektrofores för detektion elimineras med re altids-PCR-tekniken. Användningen av fluorescerande färgämnen för att märka PCR-produkter under PCR-reaktionerna kommer så småningom att leda till direkt kvantifiering. När PCR-produkterna ackumuleras, ackumuleras också de fluorescerande signalerna, och de kommer att mätas av re altidsmaskinen. SYBR Green och Taqman är två metoder för att upptäcka eller titta på amplifieringsprocessen av re altids-PCR. Båda metoderna övervakar förstärkningsprocessens framsteg och rapporterar produktens kvantitet i re altid.
Figur 03: Re altids-PCR
Re altids-PCR har en mängd olika tillämpningar såsom kvantifiering av genuttryck, mikroRNA och icke-kodande RNA-analys, SNP-genotypning, detektering av kopienummervarianter, detektion av sällsynta mutationer, detektion av genetiskt modifierade organismer och upptäckt av smittämnen.
Vilka är likheterna mellan konventionella kapslade och re altids-PCR-analyser?
- Inkapslade och re altids-PCR-analyser är modifieringar av konventionella PCR-analyser.
- Alla tre teknikerna amplifierar DNA-prover.
- Deras produkter kan användas i sekvensering eller analys.
- Dessa analyser kräver primers.
Vad är skillnaden mellan konventionella kapslade och re altids-PCR-analyser?
Konventionell PCR är en teknik utvecklad för att amplifiera specifika sekvenser av DNA. Under tiden är Nested PCR en modifiering av konventionell PCR som består av två sekventiella amplifieringsreaktioner, och re altids-PCR är en variant av konventionell PCR som kan kvantifiera den amplifierade produkten. Så detta är nyckelskillnaden mellan konventionella kapslade och re altids-PCR-analyser. Till skillnad från konventionell och re altids-PCR använder kapslade PCR två primeruppsättningar. Dessutom finns det två på varandra följande amplifieringsreaktioner i kapslad PCR för att minska ospecifik amplifiering. dessutom innehåller de konventionella och re altids-PCR-analyserna inte två sekventiella amplifieringsreaktioner.
Följande infografik listar skillnaderna mellan konventionella kapslade och re altids-PCR-analyser i tabellform för jämförelse sida vid sida.
Sammanfattning – konventionella vs kapslade vs re altids-PCR-analyser
Konventionell PCR är den första tekniken som utvecklats för att amplifiera specifika fragment av DNA. Kapslad PCR och re altids-PCR är två varianter av konventionell PCR. Det finns två sekventiella amplifieringsreaktioner och användningen av två primeruppsättningar i kapslad PCR. Re altids-PCR är utvecklat för att kvantifiera den amplifierade PCR-produkten. Detta sammanfattar alltså skillnaden mellan konventionella kapslade och re altids-PCR-analyser.
