nyckelskillnad – PCR-primers vs sekvenseringsprimers
Med den senaste utvecklingen inom området molekylärbiologi utvecklades olika genetiska tekniker som gjorde undersökningsprocesserna på olika vägar av ämnet enkla och exakta. PCR och andra sekvenseringsförfaranden är två viktiga sådana tekniker. De använder olika delkomponenter. Primers anses vara den huvudsakliga delkomponenten som är gemensam för både PCR- och sekvenseringstekniker. PCR-primrar används för amplifiering av en viss DNA-sekvens medan sekvenseringsprimrar används i samband med sekvensering av ett DNA-fragment med avsikten att avslöja dess specifika ordning av nukleotidsekvensen. Detta är den viktigaste skillnaden mellan PCR-primrar och sekvenseringsprimrar.
Vad är PCR-primers?
Polymerase Chain Reaction (PCR) är en genetisk teknik som används inom molekylärbiologin för att amplifiera en enda eller få kopior av ett visst DNA-segment och för att erhålla många miljoner identiska kopior. I en PCR-reaktion används olika komponenter inklusive primers. Primers är korta DNA-strängar med en nukleotidlängd på 18-25, vilket gör dem kompatibla med start- och slutregionen av DNA-fragmenten som ska amplifieras. Primers kan vara en framåtriktad primer och en omvänd primer. Dessa primrar binder till DNA-fragmentet vid de specifika punkter där det gör att DNA-polymeras binder till den specifika primern på platsen och initierar syntesen av den nya DNA-strängen.
Valet av primers är en viktig aspekt av PCR-processen. Valet av längden på primern är viktigt. Den ideala längden skulle vara 18-25 nukleotider. Om längden är för kort eller för lång kommer primrarna inte att binda till DNA-sekvensen för att amplifieras korrekt. Primers som är för korta i längd leder till ospecifik primer-annealing på olika platser i DNA-sekvensen.
Figur 01: PCR-primers
Innehållet av guanin och cytosin (GC) i en bra primer bör ligga i intervallet 40-60. Primerglödgningstemperaturen och smälttemperaturen är viktiga faktorer under PCR. Smälttemperaturen bör beräknas noggrant, och primer-glödgningstemperaturen bör vara 5 0C lägre än smälttemperaturen. Smälttemperaturen bör vara 60 °C och 75 °C. För höga eller för låga temperaturer kommer att resultera i mindre aktiv DNA-polymerasaktivitet.
Vad är Sequencing Primers?
Sekvenseringsprimrar används i samband med sekvensering av ett DNA-fragment med avsikten att avslöja dess specifika identitet. För att få bra sekvenseringsresultat är högkvalitativa primrar och mallar viktiga. Sålunda, när primrar väljs, bör de vara unika för en speciell region där vi önskar sekvensera. Det bör också vara med en korrekt orientering där sekvenserna vanligtvis genereras från 3' till 5' ändar av primrarna. Sekvensen bör sakna oönskad självhybridisering såsom bildandet av hårnålsslingor. Den bör inte innehålla på varandra följande bildning av guaninbaser.
Smälttemperaturen (Tm) för primern måste vara lämplig för förhållandena för sekvenseringen. Därför bör den ligga mellan 52oC och 74oC. Framställning av oligonukleotider som ska användas som en primer bör renas för att erhålla den önskade fullängden av sekvensen. Om oligonukleotiderna innehåller föroreningar, kommer primersekvenssignaleringen att läggas över från olika primingsställen, och det kommer också att minska antalet basceller.
Figur 02: Sequencing Primers
Primerns smälttemperatur (Tm) för en oligonukleotid bestämmer hur starka de komplementära DNA-strängarna hybridiseras med varandra. Tm kan betraktas som en termodynamisk beräkning där den är beroende av både DNA-sekvenser och flera förhållanden såsom s altkoncentration. Tm är viktigt under PCR där en variant som kallas cykelsekvensering används för att producera en grupp av dideoxinukleotidterminerade fragment. Här kommer primern som sekvenseras initi alt att hybridiseras alternativt, sedan förlängas och slutligen denatureras för amplifiering. Därför bör Tm-värdet vara mellan 52oC och 74o C. Syntetiserade oligonukleotider kan erhållas från DNA/RNA-synteslaboratorier enligt val. Den lilla syntesskala som används för DNA-sekvensering är vanligtvis 50 nmol. Det viktigaste är också att primrarna som används för sekvensering ska renas så att de är fria från föroreningar som förhindrar kvalitetsförsämring.
Vilka är likheterna mellan PCR-primers och sekvenseringsprimers?
- Både PCR-primrar och sekvenseringsprimrar är primrar som används i amplifieringsprocessen av en målriktad DNA-sekvens.
- Både PCR-primers och sekvenseringsprimrar är sammansatta av nukleotider.
- Både PCR-primers och Sequencing Primers är korta oligomerer.
Vad är skillnaden mellan PCR-primers och sekvenseringsprimers?
PCR-primers vs Sequencing Primers |
|
| PCR-primrar är korta DNA-strängar med en nukleotidsekvenslängd på 18-25, vilket gör dem kompatibla med start- och slutregionen av DNA-fragmenten som ska amplifieras. | Sekvenseringsprimrar är korta oligomerer som används i samband med sekvensering av ett DNA-fragment med avsikten att avslöja dess specifika identitet. |
| Funktion | |
| PCR-primrar används för amplifiering av en viss DNA-sekvens. | Sekvenseringsprimrar används i samband med sekvensering av ett DNA-fragment med avsikten att avslöja dess specifika identitet. |
| Antal primers som behövs | |
| Två primers; en framåt-primer och en omvänd primer används som PCR-primer. | Behöver bara en primer som sekvenseringsprimer. |
Sammanfattning – PCR-primers vs Sequencing Primers
Sekvenseringsprimrar används i samband med sekvensering av ett DNA-fragment med avsikten att avslöja dess specifika identitet. En sekvenseringsprimer räcker för att köra processen. För att få bra sekvenseringsresultat är primers och mallar av hög kvalitet viktiga. Sålunda, när primrar väljs, bör de vara unika för en speciell region där vi önskar sekvensera. PCR-primrar är korta DNA-strängar med en nukleotidlängd på 18-25 som är kompatibla med start- och slutregionen av DNA-fragmenten som ska amplifieras. PCR-primrar kan vara en framåtriktad primer och en omvänd primer. Innehållet av guanin och cytosin (GC) i en bra primer bör vara i intervallet 40-60. Primerglödgningstemperaturen och smälttemperaturen är viktiga aspekter under PCR. Detta är skillnaden mellan PCR-primers och Sequencing-primers.
