nyckelskillnad – mikroarray vs RNA-sekvensering
Transkriptom representerar hela innehållet av RNA som finns i en cell inklusive mRNA, rRNA, tRNA, nedbrutet RNA och icke-nedbrutet RNA. Profilering av transkriptom är en viktig process för att förstå cellinsikterna. Det finns flera avancerade metoder för transkriptomprofilering. Microarray och RNA-sekvensering är två typer av teknologier som utvecklats för att analysera transkriptom. Den viktigaste skillnaden mellan mikroarray och RNA-sekvensering är att mikroarray är baserad på hybridiseringspotentialen hos fördesignade märkta prober med mål-cDNA-sekvenser medan RNA-sekvensering baseras på direkt sekvensering av cDNA-strängar med avancerade sekvenseringstekniker som NGS. Microarray utförs med förkunskapen om sekvenserna och RNA-sekvensering utförs utan förkunskapen om sekvenser.
Vad är Microarray?
Microarray är en robust, pålitlig och hög genomströmningsmetod som används för transkriptomprofilering av forskare. Det är den mest populära metoden för transkriptionsanalys. Det är en lågkostnadsmetod som beror på hybridiseringssonderna.
Tekniken börjar med extraktion av mRNA från provet och konstruktion av cDNA-bibliotek från tot alt RNA. Sedan blandas det med fluorescensmärkta fördesignade prober på en fast yta (punktmatris). Komplementära sekvenser hybridiserar med de märkta proberna i mikroarrayen. Därefter tvättas och screenas mikroarrayen och bilden kvantifieras. Insamlade data bör analyseras för att få de relativa uttrycksprofilerna.
Intensiteten hos mikroarraysonderna antas vara proportionell mot mängden transkript i provet. Teknikens noggrannhet beror emellertid på de designade proberna, förkunskaper om sekvensen och probernas affinitet för hybridisering. Därför har mikroarrayteknologi begränsningar. Mikroarrayteknik kan inte utföras med transkript med låg förekomst. Det misslyckas med att differentiera isoformer och identifiera genetiska varianter. Eftersom denna metod beror på hybridisering av prober, uppstår vissa problem relaterade till hybridisering såsom korshybridisering, ospecifik hybridisering etc. i mikroarrayteknik.
Figur 01: Microarray
Vad är RNA-sekvensering?
RNA shotgun-sekvensering (RNA-seq) är en nyligen utvecklad hel transkriptomsekvenseringsteknik. Det är en snabb och hög genomströmningsmetod för transkriptomprofilering. Det kvantifierar direkt uttrycket av gener och resulterar i djupgående undersökningar av transkriptomet. RNA-sekvens beror inte på fördesignade prober eller förkunskaper om sekvenserna. Därför har RNA-seq-metoden hög känslighet och förmåga att detektera nya gener och genetiska varianter.
RNA-sekvenseringsmetod utförs via flera steg. Tot alt RNA i cellen måste isoleras och fragmenteras. Sedan, med användning av omvänt transkriptas, måste ett cDNA-bibliotek förberedas. Varje cDNA-sträng måste ligeras med adaptrar. Sedan måste de ligerade fragmenten amplifieras och renas. Slutligen med en NGS-metod måste sekvensering av cDNA:t utföras.
Figur 02: RNA-sekvensering
Vad är skillnaden mellan Microarray- och RNA-sekvensering?
Microarray vs RNA-sekvensering |
|
| Microarray är en robust, pålitlig metod med hög genomströmning. | RNA-sekvensering är en exakt metod med hög genomströmning. |
| Kostnad | |
| Detta är en lågkostnadsmetod. | Det här är en dyr metod. |
| Analys av ett stort antal prover | |
| Detta underlättar att analysera ett stort antal prover samtidigt. | Detta underlättar analysen av ett stort antal prover. |
| Dataanalys | |
| Dataanalys är komplex. | Mer data genereras med den här metoden; därför är processen mer komplex. |
| Föregående kunskap om sekvenser | |
| Denna metod är baserad på hybridiseringsprober, så förkunskaper om sekvenser krävs. | Denna metod beror inte på tidigare sekvenskunskaper. |
| Strukturella variationer och nya gener | |
| Denna metod kan inte upptäcka strukturella variationer och nya gener. | Den här metoden kan upptäcka strukturella variationer såsom genfusion, alternativ splitsning och nya gener. |
| Känslighet | |
| Detta kan inte upptäcka skillnader i uttryck av isoformer, så detta har begränsad känslighet. | Detta har hög känslighet. |
| Utfall | |
| Detta kan bara resultera i relativa uttrycksnivåer. Detta ger inte absolut kvantifiering av genuttryck. | Det ger absoluta och relativa uttrycksnivåer. |
| Data Reanalysis | |
| Detta måste köras igen för att kunna analysera om. | Sekvenseringsdata kan analyseras på nytt. |
| Behov av specifik personal och infrastruktur | |
| Specifik infrastruktur och personal krävs inte för mikroarray. | Specifik infrastruktur och personal som krävs av RNA-sekvensering. |
| Technical Issues | |
| Microarray-tekniken har tekniska problem som korshybridisering, ospecifik hybridisering, begränsad detektionshastighet för enskilda sönder, etc. | RNA seq-teknik undviker tekniska problem som korshybridisering, ospecifik hybridisering, begränsad detektionshastighet för individuella prober, etc. |
| Biases | |
| Detta är en partisk metod eftersom den beror på hybridisering. | Bias är låg jämfört med microarray. |
Sammanfattning – Microarray vs RNA-sekvensering
Microarray- och RNA-sekvenseringsmetoder är högkapacitetsplattformar utvecklade för transkriptomprofilering. Båda metoderna ger resultat som är starkt korrelerade till genuttrycksprofiler. RNA-sekvensering har dock fördelar jämfört med mikroarray för genuttrycksanalys. RNA-sekvensering är en mer känslig metod för detektion av transkript med låg förekomst än mikroarray. RNA-sekvensering möjliggör också differentiering mellan isoformer och identifiering av genvarianter. Mikroarray är dock det vanligaste valet för de flesta forskare eftersom RNA-sekvensering är en ny och dyr teknik med datalagringsutmaningar och komplex dataanalys.
