Nyckelskillnad – Northern vs Southern vs Western Blotting
Detektion av specifika sekvenser av DNA, RNA och proteiner är avgörande för olika typer av studier inom molekylärbiologi. Gelelektrofores är en teknik som separerar DNA, RNA och proteiner efter deras storlekar. Från gelprofilerna detekteras speciell DNA-sekvens, RNA-sekvens eller protein genom de speciella tekniker som kallas blotting och hybridisering med märkta prober. Det finns tre olika typer av blottingmetoder nämligen södra, norra och västra. Den viktigaste skillnaden mellan nordlig södra och västlig blotting ligger i vilken typ av molekyl den detekterar från ett prov. Southern blotting är en metod som detekterar en specifik DNA-sekvens från ett DNA-prov. Northern blotting är en teknik som detekterar en specifik RNA-sekvens från ett RNA-prov. Western blotting är en metod som detekterar ett specifikt protein från ett proteinprov.
Vad är Southern Blotting?
Southern blotting-teknik utvecklades av E. M. Southern 1975 för identifiering av en specifik DNA-sekvens från ett DNA-prov. Detta är den första blottingtekniken som introduceras inom molekylärbiologin. Det möjliggjorde detektering av specifika gener från DNA, specifika fragment från DNA, etc. Det finns flera steg involverade i southern blotting-teknik. De är följande.
- DNA isoleras från provet och spjälkas med restriktionsendonukleaser.
- Smält prov separeras med agarosegelelektrofores.
- DNA-fragment i gelén denatureras till enkelsträngar med hjälp av en alkalisk lösning.
- Enkelsträngat DNA överförs till ett nitrocellulosafiltermembran genom kapilläröverföring.
- Överfört DNA fixeras permanent på membranet.
- Fast DNA på membranet hybridiseras med märkta prober.
- Obundet DNA tvättas bort från membranet genom tvättning.
- Röntgenfilm exponeras för membranet och en autoradiograf förbereds.
Southern blotting används för olika aspekter av molekylärbiologi. Det är användbart vid RFLP-kartläggning, krimin altekniska studier, DNA-metylering vid genuttryck, detektion av muterade gener i genetiska störningar, DNA-fingeravtryck, etc.
Figur 01: Southern Blotting Technique
Vad är Northern Blotting?
Northern blotting är en metod utformad för att detektera en specifik RNA-sekvens eller mRNA-sekvens från ett prov för att studera genuttryck. Denna teknik utvecklades av Alwine, Kemp och Stark 1979. Den skiljer sig från de södra och västerländska blottingteknikerna på grund av flera steg. Denna teknik utförs emellertid också via gelelektrofores, blotting och hybridisering med specifika märkta prober och detektion. Northern blotting-teknik utförs enligt följande.
- RNA extraheras från provet och separeras med gelelektrofores.
- RNA överförs från gelén till ett blotting-membran och fixeras.
- Membranet behandlas med en märkt sond framställd av cDNA eller RNA (proben är komplementär till en specifik sekvens i provet).
- Sonden inkuberas med membranet för att binda med en specifik sekvens.
- Obundna sonder tvättas bort.
- Hybridiserade fragment detekteras med en autoradiograf.
Northern blotting är ett viktigt verktyg för att detektera och kvantifiera hybridiserat mRNA, studera RNA-nedbrytning, utvärdering av RNA-halveringstid, detektion av RNA-splitsning, studera genuttryck, etc.
Figur 02: Northern Blotting
Vad är Western Blotting?
Western blotting är en metod för att detektera ett specifikt protein från en proteinblandning genom att använda märkta antikroppar. Därför är western blot också känd som en immunoblot. Denna teknik introducerades av Towbin et al 1979 och den utförs nu rutinmässigt i laboratoriet för proteinanalys. Stegen är som följer.
- Proteiner extraheras från provet
- Proteiner separeras efter sina storlekar med polyakrylamidgelelektrofores
- Separerade molekyler överförs till ett PVDF-membran eller nitrocellulosamembran genom elektroporering
- Membranet är blockerat för ospecifik bindning med antikropparna
- Överförda proteiner är bundna med primär antikropp (enzymmärkta antikroppar).
- Membranet tvättas för att avlägsna ospecifikt bundna primära antikroppar
- Bundna antikroppar detekteras genom att lägga till ett substrat och detektera den färgade fällningen som bildas
Western blotting är användbart vid detektion av anti-HIV-antikroppar i ett humant serumprov. Western blot kan också användas som ett bekräftande test för hepatit B-infektion och definitivt test för galna ko-sjukdom.
Figur 03: Western Blotting
Vad är skillnaden mellan Northern Southern och Western Blotting?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Typ av molekyl upptäckt | |
| Northern Blotting | Northern blotting detekterar en specifik RNA-sekvens från ett RNA-prov. |
| Southern Blotting | Southern blotting detekterar en specifik DNA-sekvens från ett DNA-prov. |
| Western Blotting | Western blotting detekterar ett specifikt protein från ett proteinprov. |
| Typ av gel | |
| Northern Blotting | Detta använder agaros/formaldehydgel. |
| Southern Blotting | Detta använder en agarosegel. |
| Western Blotting | Detta använder polyakrylamidgel. |
| Blottmetod | |
| Northern Blotting | Detta är en kapilläröverföring. |
| Southern Blotting | Detta är en kapilläröverföring. |
| Western Blotting | Detta är en elektrisk överföring. |
| Sondar som används | |
| Northern Blotting | cDNA- eller RNA-sonder märkta radioaktivt eller icke-radioaktivt. |
| Southern Blotting | DNA-sonder är märkta radioaktivt eller icke-radioaktivt. |
| Western Blotting | Primära antikroppar används som prober. |
| Detektionssystem | |
| Northern Blotting | Detta görs med hjälp av en autoradiograf, eller detektering av ljus eller färgförändring. |
| Southern Blotting | Detta görs med en autoradiograf, detektering av ljus eller färgförändring. |
| Western Blotting | Detta görs genom att detektera ljus eller färgförändringar. |
Sammanfattning – Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotting är en speciell teknik utvecklad för identifiering av specifikt DNA, RNA eller protein från proverna. Det finns tre separata blottingprocedurer, nämligen nordlig, sydlig och västlig, för att detektera en specifik typ av molekyl. Northern blotting-teknik är utformad för att detektera en specifik RNA-sekvens från en blandning av RNA. Southern blotting-teknik möjliggör detektering av en specifik DNA-sekvens från ett DNA-prov och western blotting-teknik har utvecklats för att identifiera ett specifikt protein från en proteinblandning.
