nyckelskillnad – nitrocellulosa vs PVDF
Western blotting är en metod som möjliggör detektion och kvantifiering av specifika proteiner från ett proteinprov. Teknikens tillförlitlighet beror på valet av ett korrekt membran för absorption av proteiner från gelén. Det finns olika typer av mikroporösa membran. Nitrocellulosa- och PVDF-membran är två sådana membran som föredras av forskarna på grund av deras speciella egenskaper framför andra typer av membran. Valet mellan nitrocellulosa eller PVDF är också en annan utmaning i western blotting. Både nitrocellulosa och PVDF har en hög proteinabsorptionsförmåga. Den viktigaste skillnaden mellan nitrocellulosa och PVDF-membran är att nitrocellulosamembran inte har förmågan att ta bort antikroppar och återanvända membranet för antikroppsreprobing medan PVDF-membran har strippnings- och återanvändningsförmåga.
Vad är nitrocellulosa?
Nitrocellulosa är en polymer som tillverkas genom att behandla cellulosa med salpetersyra och används för att göra mikroporösa membran inom molekylärbiologin, speciellt för blottingtekniker som southern, northern och western blotting. Porstorlekar på nitrocellulosamembran varierar från 3 till 20 µm. Nitrocellulosa mikroporösa membran underlättar detekteringen av immunokemiska reaktioner som sker på membranets yta. Därför används ofta nitrocellulosamembran för immobilisering av proteiner och detektion av specifika proteiner i western blotting. Nitrocellulosamembran kan också immobilisera glykoproteiner och nukleinsyror.
Nitrocellulosamembran föredras i sidoflödesanalyser på grund av flera egenskaper. Nitrocellulosamembran absorberar proteiner i hög koncentration. Lösningsmedlet som används för att väta membranet minskar inte absorptionen av nitrocellulosamembranprotein. Nitrocellulosamembran kan lätt skäras till önskad gelstorlek och överföra proteiner från gelén till membranet genom elektrisk eller kapillär överföring. Nitrocellulosa tillåter snabbare flöde av proteiner genom membranet med hög bindningspotential. Nitrocellulosa visar en förbättrad hanteringsstyrka. En annan speciell egenskap hos nitrocellulosamembran är att det enkelt kan limmas med vattenbeständiga lim som inte är lösningsmedel på olika plastunderlag.
Figur 01: Nitrocellulosamembran för western blotting
Vad är PVDF?
Polyvinylidendifluorid (PVDF) är fluorpolymer framställd genom polymerisation av vinylidendifluorid och har en hög immobiliseringsförmåga av proteiner. Därför används mikroporösa membran gjorda av PVDF i western blotting-tekniker för att analysera specifika proteiner från blandningarna av proteiner. PVDF-membran kan också användas för aminosyraanalys och proteinsekvensering. Den viktigaste egenskapen hos PVDF-membran över nitrocellulosamembran är att det enkelt kan tas bort från antikropparna och återanvändas för efterföljande antikroppssonder.
PVDF-membran är tjockare än nitrocellulosamembran; därmed mer motståndskraftig mot skador vid återanvändning. PVDF-membran är mycket hydrofoba. Därför måste de blötläggas i metanol eller isopropanol före användning.
Vad är skillnaden mellan nitrocellulosa och PVDF?
Nitrocellulosa vs PVDF |
|
| Nitrocellulosa är en polymer som består av cellulosa. | PVDF är en fluorpolymer framställd genom polymerisation av vinylidendifluorid. |
| Membranporstorlek | |
| Typiska porstorlekar är 0,1, 0,2 eller 0,45μ | Typiska porstorlekar är 0,1, 0,2 eller 0,45μm |
| Proteinbindningskapacitet | |
| Nitrocellulosa har en proteinbindningskapacitet på 80 till 100 μg/cm2. | PVDF har en proteinbindningskapacitet på 170 till 200 μg/cm2. |
| Känslighet | |
| Detta har en låg känslighet jämfört med PVDF. | Detta har en hög känslighet. |
| Detektion av lågt uttryckta proteiner | |
| Eftersom känsligheten är låg i nitrocellulosamembran är den inte lämplig för detektion av lågt uttryckta proteiner. | Detta är mer lämpligt för detektering av lågt uttryckta proteiner på grund av dess höga känslighet. |
| Bakgrundsljud | |
| Detta har lägre bakgrundsljud | Detta har högre bakgrundsljud. |
| Interaktioner med proteiner | |
| Proteinmolekyler binder till nitrocellulosamembran genom hydrofoba interaktioner. | Proteiner binder till PVDF-membran genom hydrofoba och dipolinteraktioner. |
| Membranets natur | |
| Nitrocellulosa är skör och skör. Det finns dock versioner av nitrocellulosa och de är resistenta. | PVDF är mer hållbart och har högre kemisk resistens. |
| Förmåga att strippa och återanvända | |
| Nitrocellulosa kan ha svårt att strippa och reprobera utan att tappa signalen. | PVDF är idealiskt för reprobing och sekvensering av applikationer. |
| Lämplighet | |
| Nitrocellulosa är idealisk för att detektera lågmolekylära proteiner. | PVDF är mer lämpligt för att detektera proteiner med högre molekylvikt. |
| Andra användningsområden | |
| Nitrocellulosa kan användas för nukleinsyraanalys och dot/slot blotting. | PVDF kan användas för proteinsekvensering och fastfasanalyssystem. |
| Kostnad | |
| Detta är billigare än PVDF-membran. | Detta är dyrare än nitrocellulosamembran. |
| Need for Pre-wetting | |
| Nitrocellulosamembran kräver inte förblötning med metanol | PVDF-membran kräver förblötning med metanol. |
Sammanfattning – Nitrocellulosa vs PVDF
Nitrocellulosamembran var de första membran som användes kommersiellt för sidoflödesanalys. De har en hög förmåga att absorbera proteiner. Därför används nitrocellulosamembran i western blotting. PVDF är en annan typ av membran som används i western blotting och den har också en hög proteinabsorptionsförmåga. Båda typerna används i western blotting för proteinanalys. Men PVDF-membran har mer speciella egenskaper, vilket gör dem mer lämpade än nitrocellulosamembran för western blotting. Men nitrocellulosamembran är mer lämpade för att detektera lågmolekylära proteiner, PVDF-membran är mer lämpade för att detektera högmolekylära proteiner. Detta är skillnaden mellan nitrocellulosa och PVDF-membran.
