Key Difference – Nick Translation vs Primer Extension
Nick-översättning och primerförlängning är två viktiga tekniker som utförs inom molekylärbiologi. Den viktigaste skillnaden mellan nick-translation och primerförlängning är att nick-translationsprocessen producerar märkta prober för andra hybridiseringstekniker medan primerförlängningsmetoden identifierar en specifik RNA-sekvens från en blandning och avslöjar information om uttrycket av mRNA. Båda teknikerna har stor betydelse och utförs rutinmässigt i molekylära forskningslabb.
Vad är Nick Translation?
Nick translation är en viktig teknik som används för att förbereda märkta prober för olika molekylärbiologiska tekniker såsom blotting, in situ hybridisering, fluorescerande in situ hybridisering etc. Det är en in vitro-metod för DNA-märkning. DNA-sonder används för att identifiera specifika DNA- eller RNA-sekvenser. Med hjälp av en märkt sond kan specifika fragment markeras eller visualiseras från en komplex blandning av nukleinsyra. Därför framställs märkta prober med användning av olika tekniker för att användas för olika tekniker. Nick translation är en sådan metod som producerar märkta prober med hjälp av DNas 1 och DNA polymeras 1 enzymer.
Neck-översättningsprocessen börjar med DNase 1-enzymaktivitet. DNas 1 introducerar hack i fosfatryggraden i dubbelsträngat DNA genom att klyva fosfodiesterbindningar mellan nukleotider. När nicket har skapats kommer fri 3' OH-grupp av nukleotiden att ge och DNA-polymeras 1-enzym kommer att verka på den. 5' till 3' exonukleasaktivitet av DNA-polymeras 1 tar bort nukleotider från hacket mot 3'-riktningen av DNA-strängen. Samtidigt fungerar polymerasaktiviteten hos DNA-polymeras 1-enzym och lägger till nukleotider för att ersätta de avlägsnade nukleotiderna. Om nukleotiderna var märkta, kommer ersättningen att ske med de märkta nukleotiderna och det kommer att markera DNA:t för identifiering. Detta nysyntetiserade märkta DNA kan användas som prober i olika hybridiseringsreaktioner inom molekylärbiologi.
Figur 01: Nicköversättningsprocess
Vad är Primer Extension?
Primer extension är en teknik som används för att hitta specifik RNA-sekvens från en RNA-blandning och lokalisera 5'-änden av mRNA-transkriptet. Det används också för att studera strukturen av RNA och uttryck. Primerförlängningsmetoden utförs med märkta primrar eller med märkta nukleotider. Om märkta primrar används utesluter det behovet av att märka nukleotiderna som används för syntesen av cDNA. Det finns flera steg i denna teknik. Det börjar med extraktion av RNA från provet. Sedan tillsätts en märkt oligonukleotidprimer till blandningen tillsammans med de nödvändiga ingredienserna för att syntetisera cDNA av en specifik RNA-sekvens. Primer hybridiserar med den komplementära sekvensen från blandningen. Genom att använda den primer-annealade sekvensen som mall, syntetiserar enzymet omvänt transkriptas RNA-sekvensens komplementära DNA (cDNA). Primer-annealing och omvänd transkription inträffar endast när den specifika RNA-sekvensen finns i provet. Slutligen, när denaturerande gelelektrofores utförs, kan storleken på RNA-sekvensen bestämmas. Det är också lätt att hitta +1-basen för mRNA-sekvensen (transkriptionsinitieringsställe) med primerförlängningsmetoden. Mängden mRNA som finns i provet kan kvantifieras med denna metod om överskott av primer används.
Figur 02: Primer-förlängning
Vad är skillnaden mellan Nick Translation och Primer Extension?
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| Nick-översättning är en process som skapar märkta DNA-sonder för olika hybridiseringsreaktioner. | Primer extension är en teknik som används för att hitta specifikt RNA eller för att studera genuttryck. |
| Enzymer som används | |
| DNase 1 och DNA-polymerasenzymer används. | Omvänt transkriptasenzym används. |
| Viktighet | |
| Nick-översättning underlättar märkningen av specifik DNA-sekvens. | Primerförlängning möjliggör detektering av specifik mRNA-sekvensstorlek och mängden närvarande i provet. |
Sammanfattning – Nick Translation vs Primer Extension
Nick translation är en metod som används för att syntetisera märkta prober baserat på aktiviteterna hos DNase 1 och E coli DNA polymeras 1 enzymer. Det är en in vitro-metod som används i laboratorierna före olika hybridiseringstekniker. Under nick-translationen tar 5'-3' exonukleasaktiviteten av DNA-polymeras 1 bort nukleotider före nicken och polymerasaktiviteten för DNA-polymeras 1 ersätter de borttagna nukleotiderna med märkta nukleotider bakom nicken. Primerförlängning är en metod som används för att detektera ett specifikt RNA-transkript från en blandning och kvantifiera storleken och mängden av intresse-RNA. Detta är skillnaden mellan nick-översättning och primerförlängning.
