Nyckelskillnaden mellan nick-translation och ändfyllning är att nick-translation är en process som skapar märkta DNA-sonder för olika hybridiseringsreaktioner medan ändfyllning är en teknik som skapar trubbiga fragment genom att lägga till nukleotider i enkelsträngade överhäng.
Nick-översättning och slutfyllning är två tekniker som används inom molekylärbiologi. Nick-translation används för att märka prober för hybridisering för att detektera specifika nukleotidsekvenser. Ändfyllning används för att göra trubbiga fragment som hade klibbiga ändar med enkelsträngade överhäng. Båda teknikerna har stor betydelse, och de utförs rutinmässigt i molekylära forskningslabb.
Vad är Nick Translation?
Nick translation är en viktig teknik som används för att förbereda märkta prober för olika molekylärbiologiska tekniker såsom blotting, in situ hybridisering, fluorescerande in situ hybridisering, etc. Det är en in vitro metod för DNA-märkning. DNA-sonder används för att identifiera specifika DNA- eller RNA-sekvenser. Med hjälp av en märkt sond kan specifika fragment markeras eller visualiseras från en komplex blandning av nukleinsyra. Därför framställs märkta prober med användning av olika tekniker. Nick translation är en sådan metod som producerar märkta prober med hjälp av DNas 1 och DNA polymeras 1 enzymer.
Figur 01: Nick Translation
Nick-översättningsprocessen börjar med DNase 1-enzymaktivitet. DNas 1 introducerar hack i fosfatryggraden i dubbelsträngat DNA genom att klyva fosfodiesterbindningar mellan nukleotider. När nicket har skapats kommer fri 3′ OH-grupp av nukleotiden att produceras, och DNA-polymeras 1-enzym kommer att verka på den. 5′ till 3′ exonukleasaktivitet av DNA-polymeras 1 tar bort nukleotider från hacket mot 3′-riktningen av DNA-strängen.
Samtidigt fungerar polymerasaktiviteten för DNA-polymeras 1-enzym och lägger till nukleotider för att ersätta de borttagna nukleotiderna. Om nukleotiderna är märkta, kommer ersättningen att ske med de märkta nukleotiderna, och det kommer att markera DNA:t för identifiering. Slutligen kan detta nysyntetiserade märkta DNA användas som prober i olika hybridiseringsreaktioner.
Vad är slutfyllning?
End filling är en teknik som används inom molekylärbiologi för att göra trubbiga fragment. Restriktionssmältning producerar fragment med överhäng. Dessa fragment kanske inte är kompatibla att ligera in i plasmidvektorer. Vektorer är ofta trubbiga för att tillåta att icke-kompatibla ändar kan sammanfogas. Därför kan fragment med överhäng göras trubbiga genom att lägga till nukleotiderna till den komplementära strängen med användning av överhänget som mall för polymerisation. Denna process kallas slutfyllning.
DNA-polymeraser såsom Klenow-fragment av DNA-polymeras I och T4 DNA-polymeras katalyserar ändfyllningen. De lägger till nukleotider för att fylla i (5′ → 3′) och tuggar tillbaka (3′ → 5′). När de klibbiga ändarna är fyllda blir de trubbiga och de är redo att bindas till en vektor.
Dessutom kan ändfyllning användas för att märka DNA-molekyler. Det kan dock endast användas för att märka DNA-molekyler med klibbiga ändar. I jämförelse med nick-översättning är ändfyllning en skonsammare metod som sällan orsakar DNA-brott.
Vilka är likheterna mellan Nick Translation och End Filling?
- Både nick-översättning och slutfyllning är molekylärbiologiska tekniker.
- De kan användas för att märka sonder.
- Båda är in vitro
Vad är skillnaden mellan Nick-översättning och slutfyllning?
Nick-översättning är en teknik som skapar märkta prober för hybridisering. Däremot är ändfyllning en teknik som skapar trubbiga fragment för ligering till vektorer. Så detta är nyckelskillnaden mellan nick-översättning och slutfyllning. Dessutom kräver Nick-översättning användning av 5'till 3′ exonukleasaktivitet medan slutfyllning inte kräver 5'till 3′ exonukleasaktivitet.
Infografiken nedan visar skillnaderna mellan nick-översättning och slutfyllning i mer detalj.
Sammanfattning – Nick Translation vs End Fylling
Nick translation är en metod som inkorporerar radioaktivt märkta nukleotider i DNA. Den syntetiserar märkta prober baserat på aktiviteterna hos DNas 1 och E. coli DNA polymeras 1 enzymer. Ändfyllning, å andra sidan, är en teknik som producerar trubbiga fragment. När fragmenten har klibbiga ändar (enkelsträngade överhäng), är det nödvändigt att göra dem trubbiga ändar för att ligera till vektorer. Ändfyllning lägger till kompatibla nukleotider och skapar trubbiga ändarfragment för att göra dem kompatibla för ligering. Detta sammanfattar alltså skillnaden mellan nick-översättning och slutfyllning.
