Den viktigaste skillnaden mellan kromatofokusering och isoelektrisk fokusering är att kromatofokusering är en typ av kolonnkromatografimetod som använder jonbytarhartser medan isoelektrisk fokusering är en typ av elektroforesteknik som använder immobiliserade pH-gradientgeler.
Kromatofokusering och isoelektrisk fokusering är två tekniker som separerar proteiner efter deras isoelektriska punkter. Både kromatofokusering och isoelektrisk fokusering har stor upplösningsförmåga. Kromatofokusering är en högupplöst kolonnkromatografimetod medan isoelektrisk fokusering är en elektroforetisk separationsmetod. Dessutom använder kromatofokusering inte ett elektriskt fält medan isoelektrisk fokusering behöver ett elektriskt fält.
Vad är kromatofokusering?
Kromatofokusering är en typ av högelueringskromatografi som separerar proteiner enligt skillnader i deras isoelektriska punkt. Den använder en jonbytarhartskolonn och en internt utvecklad pH-gradient. Till skillnad från isoelektrisk fokusering involverar kromatofokusering inte ett elektriskt fält. Kromatofokusering är en kraftfull reningsteknik som kan lösa upp mycket lika molekyler som bara skiljer sig med 0,02 pH-enheter. Därför är kromatofokusering bäst lämpad som ett sista poleringssteg när hög upplösning krävs för att separera mycket lika komponenter.
Vid kromatofokusering appliceras provet på kolonnen genom att blanda det med startbufferten. Proteiner som har ett pH över sin isoelektriska punkt är negativt laddade och de förblir nära toppen av kolonnen medan andra proteiner som har ett pH under sin isoelektriska punkt, migrerar ner i kolonnen. Proteinet med den högsta isoelektriska punkten elueras först medan proteinet med den lägsta isoelektriska punkten elueras sist från kolonnen. Denna teknik påverkas av flera faktorer som proteinutfällning och pH-gradientens linjäritet.
Vad är isoelektrisk fokusering?
Isoelektrisk fokusering är en teknik som separerar olika molekyler baserat på deras isoelektriska punkt. Det är också känt som elektrofokusering. Denna teknik används ofta för proteinseparation i en gel. Vid isoelektrisk fokusering tillsätts provet till immobiliserade pH-gradientgeler (IPG). IPG-gel är en akrylamidgelmatris sampolymeriserad med en pH-gradient. Proteinerna migrerar mot katoden tills de hittar pH-området för sina isoelektriska punkter. När ett protein når pH som inte har någon nettoladdning upphör migrationen och ger ett stationärt band. På samma sätt ger varje protein ett band vid en punkt i pH-gradienten som motsvarar dess isoelektriska punkt.
Figur 01: Isoelektrisk fokusering
Isoelektrisk fokusering är det första steget i tvådimensionell gelelektrofores. I den tekniken separeras proteiner först enligt sina isoelektriska punkter genom isoelektrisk fokusering och separeras sedan genom sin molekylvikt genom SDS-PAGE.
Vilka är likheterna mellan kromatofokusering och isoelektrisk fokusering?
- Kromatofokusering och isoelektrisk fokusering är två högupplösande metoder.
- Båda är baserade på den isoelektriska punkten hos proteiner.
- De här teknikerna använder en pH-gradient.
- Båda procedurerna är informativa för karakterisering av humana hemoglobinvarianter.
- De kan lösa upp molekyler där pI-värden skiljer sig med så lite som 0,02 pH-enheter.
Vad är skillnaden mellan kromatofokusering och isoelektrisk fokusering?
Kromatofokusering är en högupplöst kolonnkromatografiteknik som separerar proteiner enligt deras isoelektriska punkt. Däremot är isoelektrisk fokusering en elektroforetisk teknik som separerar proteiner enligt deras isoelektriska punkt genom applicering av ett elektriskt fält längs en pH-gradient som bildas i en kapillär. Så detta är den viktigaste skillnaden mellan kromatofokusering och isoelektrisk fokusering.
En annan skillnad mellan kromatofokusering och isoelektrisk fokusering är att kromatofokusering inte involverar ett elektriskt fält medan isoelektrisk fokusering behöver ett elektriskt fält.
Sammanfattning – kromatofokusering vs isoelektrisk fokusering
Kromatofokusering och isoelektrisk fokusering är två liknande tekniker som har hög upplösningsförmåga hos molekyler, särskilt mycket lika molekyler. Kromatofokusering är en högupplöst kolonnkromatografiteknik medan isoelektrisk fokusering är en elektroforesmetod. Kromatofokusering involverar inte ett elektriskt fält, till skillnad från isoelektrisk fokusering. Detta sammanfattar alltså skillnaden mellan kromatofokusering och isoelektrisk fokusering.
