Den viktigaste skillnaden mellan Golden Gate och Gibson Assembly är att Golden Gate förlitar sig på närvaron av restriktionsställen inom en viss sekvens som ska klonas, medan Gibson Assembly inte förlitar sig på närvaron av restriktionsställen inom en viss sekvens för att klonas.
Under de senaste decennierna har molekylärforskare utvecklat olika standardiserade procedurer som gör det enklare att sätta ihop flera DNA-fragment till ett enda stycke. Därför används kloningsmetoder som Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly och TOPO Cloning i stor utsträckning av forskare i vetenskapliga experiment. Därför är Golden Gate och Gibson Assembly två molekylära kloningsmetoder som tillåter sammansättning av flera DNA-fragment till ett enda stycke.
Vad är Golden Gate Assembly?
Golden Gate är en molekylär kloningsmetod som underlättar sammansättningen av flera DNA-fragment till ett enda stycke. Denna metod bygger på närvaron av restriktionsställen inom en speciell sekvens som ska klonas. Det har sitt ursprung 1996. Denna teknik använder typ IIS restriktionsenzymer och T4 DNA-ligas. Dessa enzymer skär DNA utanför igenkänningsställena. De kan skapa icke-palindromiska överhäng. Därför kan flera fragment av DNA sättas samman med kombinationer av överhängssekvenser.
Figur 01: Golden Gate
Golden Gate Montageprocedur
Golden Gate-tekniken har tre huvudsakliga steg i sin procedur:
- skapande av överhäng i kloningsvektorn,
- sammansättning av flera DNA-insättningar genom att använda fragmentspecifika sekvenser i överhäng, och
- ligation.
Golden Gate-sammansättningen använder cirkulära kloningsvektorer (destinationsvektor). Vidare, i denna metod, elimineras restriktionsstället från den ligerade produkten för att utföra nedbrytning och ligering samtidigt. Ett typiskt termiskt cykelprotokoll för Golden Gate svänger mellan 37 °C och 16 °C eftersom 37 °C är optim alt för restriktionsenzymer och 16 °C är optim alt för ligaser.
Vad är Gibson Assembly?
Gibson Assembly är en molekylär kloningsmetod som tillåter sammansättning av flera DNA-fragment till ett enda stycke. Till skillnad från Golden Gate-metoden, förlitar sig denna metod inte på närvaron av restriktionsställen inom en viss sekvens som ska klonas. Den hittades av Daniel G. Gibson från J. Craig Venter Institute. Denna teknik är en typ av sekvens- och ligasoberoende kloningsmetod (SLIC).
Figur 02: Gibson Assembly
Gibson Assembly Procedur
Gibson Assembly behöver DNA-fragment som innehåller 20-40 baspar som överlappar med intilliggande DNA-fragment. Överlappningar läggs till via PCR. Sedan läggs dessa DNA-fragment till Gibson-maserblandningen som har tre enzymer. Denna procedur utförs under isotermiska förhållanden (50 °C under 1 timme) med användning av tre olika enzymer: exonukleas, DNA-polymeras och DNA-ligas. Exonukleaset tuggar tillbaka DNA från 5'-änden. Således hämmar det inte polymerasaktivitet och tillåter reaktionen att fortgå i en enda process. De resulterande enkelsträngade regionerna på intilliggande DNA-fragment kan hybridiseras på grund av överlappande sekvenser. DNA-polymeras fyller upp luckorna genom att lägga till nukleotider. Slutligen förenar DNA-ligaset kovalent DNA från intilliggande segment. Norm alt använder Gibson Assembly linjäriserade destinationsvektorer. Dessutom kan denna metod samtidigt kombinera upp till 15 DNA-fragment baserat på sekvenslikhet.
likheter mellan Golden Gate och Gibson Assembly
- Golden Gate och Gibson Assembly är två molekylära kloningsmetoder.
- Båda metoderna kan sätta ihop flera DNA-fragment till ett enda stycke.
- Dessa metoder använder destinationsvektorer.
- Båda metoderna använder termiska cykler för sammansättning av flera DNA-fragment.
- De används i platsriktad mutagenes.
Skillnaden mellan Golden Gate och Gibson Assembly
Golden Gate är en molekylär kloningsmetod som används vid sammansättning av flera DNA-fragment till ett enda stycke som förlitar sig på närvaron av restriktionsställen inom en viss sekvens som ska klonas, medan Gibson Assembly är en molekylär kloningsmetod som används i sammansättning av flera DNA-fragment till ett enda stycke utan att förlita sig på närvaron av restriktionsställen inom en speciell sekvens som ska klonas. Detta är den viktigaste skillnaden mellan Golden Gate och Gibson Assembly. Dessutom använder Golden Gate-metoden en cirkulär destinationsvektor, medan Gibson Assembly-metoden använder en linjäriserad destinationsvektor.
Följande infografik visar skillnaden mellan Golden Gate och Gibson Assembly.
Sammanfattning – Golden Gate vs Gibson Assembly
Molekylär kloning är en metod som används för att sätta ihop rekombinanta DNA-molekyler och styra deras replikation i värdorganismer. Golden Gate och Gibson Assembly är två molekylära kloningsmetoder som tillåter sammansättning av flera DNA-fragment till ett enda stycke. Golden Gate-metoden förlitar sig på närvaron av restriktionsställen inom en viss sekvens som ska klonas, medan Gibson Assembly inte förlitar sig på närvaron av restriktionsställen inom en viss sekvens som ska klonas. Detta är alltså den viktigaste skillnaden mellan Golden Gate och Gibson Assembly.
