nyckelskillnad – genkloning vs PCR
Syntesen av många kopior av DNA från ett specifikt DNA-fragment kallas DNA-amplifiering. Det finns två huvudsakliga DNA-amplifieringsprocesser, nämligen genkloning och PCR. Den viktigaste skillnaden mellan genkloning och PCR är att genkloning producerar flera kopior av en specifik gen in vivo genom att konstruera ett rekombinant DNA och växa inuti en värdbakterie medan PCR producerar miljontals kopior av ett specifikt DNA-fragment in vitro som genomgår upprepade cykler av denaturering och syntes.
Vad är genkloning?
Genkloning är en teknik som används för att lokalisera och multiplicera en specifik gen från det extraherade genomiska DNA från en organism genom konstruktion av rekombinant DNA. Genomiskt DNA innehåller tusentals olika gener som kodas för proteiner. När DNA extraheras innehåller det alla möjliga gener som det kan bära. Genkloningsteknik har möjliggjort detektering av en specifik gen från det totala DNA:t. Därför fungerar genkloning som ett viktigt verktyg inom molekylärbiologin.
Att skapa ett genomiskt bibliotek av en organism är väsentligt vid genkloning om det inte finns någon aning om platsen för den relevanta genen i DNA:t. Ett genomiskt bibliotek skapas med följande steg.
Steg 1: Extraktion av det totala DNA:t från en organism som innehåller den önskade genen.
Steg 2: Restriktionsdigestion av det extraherade DNA:t för att producera små hanterbara fragment. Detta steg underlättas av restriktionsendonukleaser.
Steg 3: Val av en lämplig vektor och öppnande av vektorns DNA med samma restriktionsendonukleaser. Bakterieplasmider används vanligtvis som vektorer för att bära främmande DNA. Plasmider är små cirklar av DNA som finns i bakterier.
Steg 4: Kombination av vektor-DNA och fragmenterat DNA för att producera en rekombinant DNA-molekyl. Detta steg styrs av DNA-ligas.
Steg 5: Överföring av rekombinanta DNA-molekyler till värdbakterier. Det här steget kallas transformation och görs med en värmechock.
Steg 5: Screening av transformerade bakterieceller på ett odlingsmedium. En blandad population av transformerade och icke-transformerade värdceller erhålls i slutet av transformationsprocessen. Som gen av intresse inkluderar endast transformerade värdceller. Därför är det nödvändigt att välja transformerade celler. Urvalet görs med hjälp av selektiva medier som innehåller antibiotika. Endast de transformerade cellerna växer på detta screeningmedium vilket möjliggör urvalet.
Steg 6: Odling av bakterier för att producera ett genbibliotek. I detta steg införs de transformerade värdcellerna i färskt odlingsmedium som ger optimala tillväxtkrav. Tot alt antal kolonier på odlingsplattorna representerar det genomiska biblioteket för den organismen.
Steg 7: Den rekombinanta DNA-molekylen som innehåller genen av intresse måste screenas från tusentals klonade fragment av rekombinant DNA. Det kan åstadkommas genom användning av sönder som markerar den specifika genen eller det specifika proteinet som härrör från den genen.
När den intresserade genen som innehåller bakteriekolonin har identifierats från de totala kolonierna är det möjligt att göra miljontals kopior av den rekombinanta plasmiden som innehåller genen.
Genkloning används för att etablera genbibliotek, producera speciellt protein, vitaminer, antibiotika, hormoner, sekvensera och kartlägga genom av organismerna, göra flera kopior av individers DNA i krimin alteknik etc.
Figure_1: Genkloning
Vad är PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) är en teknik som genererar ett stort antal kopior av ett visst DNA-fragment. Exponentiell amplifiering av en specifik DNA-sekvens erhålls genom PCR under in vitro-betingelser. Denna teknik är ett mycket kraftfullt verktyg inom molekylärbiologi eftersom den kan multiplicera ett litet prov av DNA till en användbar mängd. PCR introducerades av Kary Mullis 1983 och denna prisbelönta uppfinning skapade ett enormt framsteg inom molekylärbiologi.
PCR-tekniken följer upprepade PCR-reaktioner som visas i figur 02. En PCR-reaktion består av tre huvudsteg som sker vid tre olika temperaturer; denaturering av dubbelsträngat DNA vid 94 0C, hybridisering av primrar vid 68 0C och strängförlängning vid 72 0 C. Därför, när PCR utförs, bör temperaturfluktuationer upprätthållas i hög grad för korrekt replikation. PCR utförs i en PCR-maskin inuti PCR-rör. PCR-rör är laddade med korrekta PCR-blandningar som innehåller mall-DNA, Taq-polymeras, primers, dNTPs och buffert. Denaturering av dubbelsträngat prov-DNA till enkelsträngat DNA görs genom att bryta vätebindningarna mellan komplementära baser vid 94 – 98 0C. Sedan exponeras enkla strängar av mall-DNA för primers. Ett par primers (framåt och bakåt) bör tillhandahållas, och de bör vara termostabila för att tolerera höga temperaturer. Primers är enkelsträngade korta DNA-sekvenser som är komplementära till ändarna av mål-DNA-fragmentet. Syntetiska primrar används vid PCR. Primers binder med de komplementära baserna av prov-DNA och initierar syntesen av en ny sträng. Detta steg katalyseras av ett enzym som kallas Taq-polymeras; ett termostabilt DNA-polymerasenzym isolerat från Thermus auqaticus. När primrar och nukleotider (byggstenar) är tillgängliga, konstruerar Taq-polymeras den nya DNA-strängen som är komplementär till mall-DNA. Vid slutet av PCR-programmet observeras amplifierat DNA-fragment med hjälp av gelelektrofores. Om ytterligare analys krävs, renas PCR-produkten från gelén.
PCR är mycket användbart för att diagnostisera och övervaka genetiska och förvärvade sjukdomar, identifiering av brottslingar (inom krimin alteknik), studera strukturen och funktionen av ett riktat segment av DNA, sekvensering och kartläggning av genom från organismer, etc. PCR har blivit en rutinmässig laboratorieteknik i medicinska och molekylärbiologiska forskningslaboratorier bland forskare eftersom den har en mängd olika tillämpningar.
Figure_2: Polymeraskedjereaktion
Vad är skillnaden mellan genkloning och PCR?
Genkloning vs PCR |
|
| Genkloning är processen att göra flera kopior av en specifik gen in vivo genom rekombinant DNA och transformera till en värdbakterie. | PCR-tekniken producerar flera kopior av en viss DNA-sekvens in vitro genom upprepade cykler av PCR-reaktioner. |
| Krav för att konstruera rekombinant DNA | |
| Rekombinant DNA produceras för att lokalisera genen. | Rekombinant DNA produceras inte. |
| Need of Labour | |
| Denna process är arbetsintensiv. | Intensivt arbete behövs inte. |
| In vivo eller in vitro process | |
| Konstruktion av rekombinant DNA är in vitro och amplifieringen av DNA är in vivo. | Amplifieringen av DNA sker helt in vitro. |
Sammanfattning – Genkloning vs PCR
Genkloning och PCR är två metoder som används för DNA-amplifiering. PCR är en in vitro-process som gör flera kopior av DNA av ett visst DNA-fragment utan att använda rekombinant DNA och en värdorganism. Genkloning är i första hand en in vivo-process som resulterar i flera kopior av en intresserad gen inuti värdorganismen via konstruktion av rekombinant DNA. Detta är skillnaden mellan genkloning och PCR.
