nyckelskillnad – kloning vs subkloning
Kloning och subkloning är molekylärbiologiska procedurer som skapar genetiskt identiska celler eller organismer som bär DNA eller gen som är av intresse. Kloning är en teknik som involverar införande av den intresserade genen eller DNA:t i en vektor, replikering av den i en värdbakterie och produktion av celler eller organismer som är exakta kopior av den genetiska sammansättningen. Subkloning är en teknik som involverar insättning av genen av intresse, som redan är insatt i en vektor, i en sekundär vektor, replikering av den i en värdbakterie och produktion av genetiskt identiska kopior av celler eller organismer. Nyckelskillnaden mellan kloning och subkloning är att, vid kloning, fortsätter genen av intresse, när den väl har ligerats in i en vektor, kloningsprocessen medan, i subkloningen, separeras den redan klonade genen av intresse från modervektorn och infogas igen i en mottagarvektor och fortsätt processen.
Vad är kloning?
Kloning är det förfarande som producerar genetiskt identiska organismer eller celler. I naturen sker kloning med hjälp av asexuell reproduktion. När det inte finns någon genetisk rekombination eller förändring får dotterceller samma genetiska sammansättning som föräldern. Prokaryota och eukaryota organismer skapar kloner genom binär fission, knoppning, mitos, etc. Inom molekylärbiologi är kloning av gener eller specifika fragment av DNA en populär metod för att studera strukturen och funktionen hos just den DNA-sektionen.
Huvudsyftet med molekylär kloning är att göra miljontals kopior av genetiskt identiska celler eller organismer som bär DNA-fragmentet av intresse (främst gener). Det skapar organismer med exakta genetiska kopior av en annan. I första hand klonas specifika gener i molekylära studier för att erhålla strukturell och funktionell information och för DNA-sekvensering. Även för produktion av specifika proteiner eller produkter i stor skala används kloning i stor utsträckning.
Kloningsprocedur
De grundläggande stegen i kloningsproceduren är följande.
- Identifiering och isolering av genen av intresse. (Amplifiering av genen av intresse genom PCR).
- Restriktionsnedbrytning av genen av intresse (Restriktionsendonukleas klippte genen).
- Restriction digestion av vektorns DNA. (Vektor-DNA skärs också med samma restriktionsendonukleas).
- Införande av genen i vektorn och bildning av den rekombinanta molekylen.
- Transformation av den rekombinanta vektorn till en värdbakterie.
- Isolering och identifiering av de transformerade bakterierna (plasmidvektorn bör innehålla en selekterbar gen, oftast en antibiotikaresistensgen för att screena transformerade bakterier).
- Rekombinant genuttryck inom värden.
Figure_01: Kloningsprocedur
Vad är subkloning?
Subkloning är en procedur för att flytta en gen av intresse från en vektor till en annan vektor för att se genens uttryck för att få den önskade funktionaliteten hos genen. I denna metod är två vektorer inblandade; nämligen överordnad vektor och destinationsvektor. Klonade insättningar flyttas igen in i en andra vektor i subkloning. Syftet med att överföra genen från den första vektorn till den andra vektorn är att erhålla något som inte kunde göras av den första vektorn eller att separera en gen igen inom det redan klonade fragmentet av DNA och uttrycka det ensamt. Restriktionsenzymer används i denna procedur i början.
Subkloningsprocedur
De grundläggande stegen för subkloning är följande.
- Med hjälp av restriktionsendonukleaser, separering av DNA av intresse i donatorplasmiden (modervektor).
- Amplifiering av DNA av intresse med PCR.
- Rening av PCR-produkten (DNA av intresse) genom gelelektrofores.
- Öppning av mottagarplasmiden med samma restriktionsendonukleaser som används för att separera DNA av intresse i moderplasmiden.
- Ligering av DNA av intresse (gen) i mottagarplasmiden för att skapa den subklonade plasmiden.
- Transformation av den subklonade vektorn till en kompetent värdbakterie.
- Skärmning av transformerade celler.
- Rening av plasmid-DNA och användning för DNA-sekvensering eller uttryck av generna för att erhålla de önskade produkterna.
Subkloning utförs vid tillfällen då en gen isoleras från den klonade gruppen av gener eller när genen av intresse måste överföras till en användbar plasmid för att se den exakta funktionen hos genen av intresse.
Figure_02: Subkloningsprocedur
Vad är skillnaden mellan kloning och subkloning?
Kloning vs Subcloning |
|
| Kloning är det förfarande som producerar genetiskt identiska organismer eller celler. | Subkloning är en procedur för att flytta en gen av intresse från en vektor till en annan vektor för att se genens uttryck för att få den önskade funktionaliteten hos genen. |
| Process | |
| Separera DNA av intresse från organismen och infogas i en vektor en gång och klonas | Redan klonat DNA separeras från den första vektorn och infogas i en andra vektor och klonas. |
| Infoga rörelse via vektorer | |
| Flyttar inte inlägg (DNA av intresse) från en vektor till en annan vektor. | Flytta inlägg från överordnad vektor till destinationsvektor. |
Sammanfattning – Kloning vs subkloning
Kloning skapar genetiskt identiska celler eller organismer med den infogade genen eller DNA av intresse. Det fortsätter genom separationen och infogningen av DNA:t av intresse i en vektor och uttryck i en värdbakterie. Subkloning delar liknande steg med kloning. Vid subkloning införs emellertid redan klonat DNA-fragment (gen av intresse) i en vektor och transformeras till en värdbakterie. Det är den viktigaste skillnaden mellan kloning och subkloning.
