Key Difference – Blunt vs Sticky End Ligation
Restriktionsendonukleaser är specifika enzymer som skär dubbelsträngat DNA (dsDNA). De är också kända som molekylära saxar inom molekylärbiologi. Restriktionsenzymer kan känna igen specifika korta sekvenser av dsDNA som kallas igenkänningsställen och klyver fosfodiester- och vätebindningar för att öppna dubbelsträngar. Som ett resultat av klyvning av dessa enzymer produceras DNA-fragment med olika typer av ändar såsom klibbiga ändar och trubbiga ändar. DNA-ligas är ett enzym som används inom molekylärbiologin för att sammanfoga två intilliggande DNA-strängar genom att bilda nya bindningar. Steget är känt som ligering och beroende på typen av den ligerade DNA-änden kan de hänvisas till som ligering med trubbiga ändar och ligering av klibbiga ändar. Den viktigaste skillnaden mellan trubbig och klibbig ändeligering är att trubbig ändeligering sker mellan DNA-fragment som innehåller två trubbiga ändar medan klibbig ändeligering sker mellan 5' och 3' överhäng. Jämfört med ligering med trubbiga ändar är klibbiga ändar mer effektiv och stabil.
Vad är en trubbig ligation?
Vissa restriktionsendonukleaser kan skära DNA vid motsatta baser och producera trubbiga DNA-fragment. Dessa enzymer är kända som skärare med trubbiga ändar; de klyver rakt ner till mitten av restriktionsstället utan att lämna enkelsträngade överhängande baser. Trubbiga ändar är också kända som icke-överhängande ändar eftersom de inte har 3' och 5' överhängande baser i ändarna. Båda strängarna slutar från baspar i trubbiga ändar. Vanliga enzymer med trubbiga ändar är EcoRV HaeIII, AluI och Smal.
Brunt end ligering är involverad mellan två trubbiga ändar. Det är inte en ligering av utskjutande baser. Denna ligering är mindre effektiv än ligering med klibbiga ändar. Men i vissa tillfällen blir ligering med trubbiga ändar mer fördelaktigt än ligering av klibbiga ändar, speciellt vid ligering av PCR-produkter. PCR-produkter tillverkas alltid med trubbiga ändar. Ligering med trubbiga ändar kräver inte komplementära ändar i DNA:t för ligeringen.
Figur 01: Trubbig produktion av Eco RV-enzym
Vad är en Sticky End Ligation?
Vissa restriktionsendonukleaser kan skära dsDNA och lämnar ett överhängande stycke enkelsträngat DNA i slutet. Dessa ändar är kända som klibbiga eller överhängande ändar. Sticky end ligering sker mellan två DNA-fragment som innehåller matchande överhäng eftersom klibbiga ändar har oparade baser och kräver komplementära baser för att bilda bindningar. Därför är det nödvändigt att använda samma restriktionsenzym för båda DNA-källorna för att producera de matchande ligeringsfragmenten.
Sticky end ligering är effektivare och är ofta mycket önskvärt i kloningsprocesser. Det finns flera restriktionsenzymer som producerar klibbiga toppar. De är EcoRI, BamHI, HindIII etc.
Figur 02: Sticky end-produktion av Eco RI-enzym
Vad är skillnaden mellan Blunt och Sticky End Ligation?
Blunt vs Sticky End Ligation |
|
| Brunt end ligering sker mellan två trubbiga ändar DNA-fragment. | Sticky end ligering sker mellan två matchande DNA-fragment med klibbiga ändar. |
| Enzymer | |
| Fräsar med trubbiga ändar ger trubbiga ändar. | Skärar med klibbiga ändar ger klibbiga eller sammanhängande ändar. |
| Krav på matchande slut | |
| Det kräver inte matchande fragment eller komplementära baser. | Det kräver komplementära baser i ändarna för att bilda baspar. |
| Effektivitet | |
| Det är mindre effektivt än klibbiga ändligering | Det är effektivare än ligering med trubbiga ändar. |
Sammanfattning – Blunt vs Sticky End Ligation
Restriktionsendonukleaser kan klyva dsDNA och producera DNA-fragment med olika ändar. De känner igen specifika sekvenser och begränsar DNA som skapar klibbiga och trubbiga ändar. Klibbiga ändar har oparade baser i slutet av fragmenten. Trubbiga ändar skapas på grund av en rak klyvning och de har baspar i ändarna. Sticky end ligering kräver två komplementära enkelsträngade DNA-bitar. Ligering med trubbiga ändar sker mellan två godtyckliga fragment av trubbiga ändar. Detta är skillnaden mellan trubbig och klibbig ligering.
