nyckelskillnad – RAPD vs RFLP
Genetiska markörer används inom molekylärbiologi för att identifiera genetiska variationer mellan individer och arter. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) och Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) är två viktiga molekylära markörer som rutinmässigt används i laboratorier. RAPD utförs med korta och godtyckliga oligonukleotidprimrar, och den är baserad på slumpmässig amplifiering av de multipla platserna i organismens mall-DNA. RFLP utförs med ett specifikt restriktionsendonukleas, och det är baserat på polymorfismen av resulterande restriktionsfragment och hybridisering. Den viktigaste skillnaden mellan RAPL och RFLP är att RAPD är en typ av PCR-teknik som utförs utan föregående sekvenskunskap medan RFLP inte är involverad i PCR och kräver förkunskap om sekvenser för att utföra tekniken.
Vad är RAPD?
RAPD är en användbar molekylär markör inom molekylärbiologi. Det är en snabb och enkel teknik. RAPD kan definieras som en metod som resulterar i polymorfa DNA-sekvenser som ett resultat av slumpmässig amplifiering av flera platser av mål-DNA-mallen. RAPD använder korta oligonukleotidprimrar med godtyckliga sekvenser för PCR-amplifieringen. Primers syntetiseras artificiellt utan förkunskap om sekvensen. Därför anses det vara en enkel och användbar teknik.
Följande viktiga steg är involverade i RAPD.
- Extraktion av mål-DNA
- Amplifiering av de multipla platserna för mål-DNA:t med hjälp av slumpmässigt valda primers
- Gelelektrofores av de amplifierade PCR-produkterna
- Fläckning med etidiumbromid och identifiering av polymorfismen
Som ett resultat av variationen i primer-annealingen genereras olika fragment med olika längder under amplifieringen. Därför är bandmönster på gelerna olika mellan individer och arter. Således möjliggör RAPD detektering av genetisk variation mellan organismer i identifiering och differentiering.
RAPD används i olika studier av molekylärbiologi såsom identifiering av den genetiska skillnaden mellan närbesläktade arter, genkartläggning, DNA-fingeravtryck, identifiering av ärftliga sjukdomar, etc.
Figur 01: RAPD
Vad är RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) är en molekylär markör som används inom molekylärbiologi för identifiering av genetisk variation i homologa DNA-sekvenser. Det är den första genetiska markören som utvecklats för DNA-fingeravtryck. Alla organismer producerar unika DNA-profiler när de begränsas med specifika restriktionsenzymer. RFLP fungerar som ett viktigt verktyg för att producera unika DNA-profiler för individer och detektering av genetisk variation bland dem. När DNA-prover spjälkas med specifika restriktionsendonukleaser, ger det olika DNA-profiler som är unika för varje individ. Därför är principen för denna metod att detektera genetisk variation bland organismer genom att begränsa homologt DNA med specifika restriktionsenzymer och analys av fragmentlängdspolymorfismen via gelelektrofores och blotting. Blottingmönster är unika för varje organism och kännetecknar de specifika genotyperna.
Följande steg är involverade i RFLP.
- Isolering av tillräcklig mängd DNA från prover
- Fragmentering av DNA-proverna med specifika restriktionsendonukleaser till kort sekvens
- Separation av de resulterande fragmenten med olika längder genom agarosgelelektrofores.
- Överföring av gelprofilen till ett membran med Southern blotting
- Hybridisering av membranet med märkta prober och analys av fragmentlängdspolymorfismen i varje profil
RFLP har olika applikationer som diagnos av arvssjukdomar, genomkartläggning, brottslig identifiering i rättsmedicinska studier, faderskapstest, etc.
Figur 02: RFLP-genotypning
Vad är skillnaden mellan RAPD och RFLP?
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD är en molekylär markör baserad på slumpmässiga primers och PCR. | RFLP är en molekylär markör baserad på produktionen av restriktionsfragment med olika längd. |
| Obligatoriskt prov | |
| Små DNA-prover räcker för RAPD-analysen. | En stor mängd extraherat DNA-prov krävs för RFLP-analys. |
| Time | |
| RAPD är en snabb process. | RFLP är en tidskrävande process. |
| Primer Use | |
| Slumpmässiga primers används och samma primers kan användas för olika arter. | Artspecifika prober används i RFLP för hybridisering. |
| Reliability | |
| Teknikens tillförlitlighet är mindre jämfört med RFLP. | RFLP är en pålitlig teknik. |
| Blotting | |
| RAPD involverar southern blotting. | Southern blotting är ett steg i RFLP. |
| Detektion av allelisk variation | |
| Alleliska variationer kan inte upptäckas av RAPD. | Alleliska variationer kan upptäckas av RFLP. |
| Need for Sequence Knowledge | |
| RAPD kräver inte tidigare sekvenskunskaper. | Före sekvenskunskaper krävs för sonddesign. |
| PCR | |
| PCR är involverat i RAPD | PCR är inte involverat i RFLP. |
| Reproducerbarhet | |
| RAPD har låg reproducerbarhet | RFLP har en hög reproducerbarhet jämfört med RAPD. |
Sammanfattning – RAPD vs RFLP
RAPD och RFLP är viktiga markörer som används inom molekylärbiologi. Båda metoderna kan detektera genetisk variation mellan organismer. RAPD utförs med användning av slumpmässiga primrar. RFLP utförs med användning av specifika restriktionsenzymer. Båda metoderna producerar DNA-profiler unika för enskilda organismer. RAPD är involverad i jämförelsevis få steg än RFLP. Men det ger mindre tillförlitliga och reproducerbara resultat än RFLP. Detta är huvudskillnaden mellan RAPD och RFLP.
