nyckelskillnad – varm vs kall trypsinisering
Varm och kall trypsinisering är två metoder som används vid enzymatisk uppdelning av celler i djurcellsodling. Den viktigaste skillnaden mellan varm och kall trypsinisering, som namnen antyder, beror på temperaturen vid vilken trypsinet tillsätts för cellulär disaggregering. Varm trypsinisering sker under högre temperaturförhållanden (36,5 – 37 0C) medan kall trypsinisering sker under låga temperaturer.
Under processen med primär cellodling av djurceller finns det tre huvudsakliga metoder som används och har visat sig vara framgångsrika. De tre metoderna inkluderar mekanisk sönderdelning av celler, enzymatisk sönderdelning av celler och den primära explantationstekniken. Enzymatisk sönderdelning av celler som leder till isolering av celler och det görs av det proteinnedbrytande enzymet trypsin. Därför är denna process känd som trypsinisering. Trypsinisering kan göras under två olika förhållanden, nämligen varm trypsinisering och kall trypsinisering. Varm trypsinisering är metoden för att behandla cellerna med trypsin under varma förhållanden vid en temperatur på 36,5 – 37 0C. Kall trypsinisering är processen för trypsinbehandling som äger rum under kallare förhållanden, helst i is som håller mycket låga temperaturer.
Vad är varm trypsinisering?
Trypsinisering kan göras för att disaggregera de cellulära komponenterna för att isolera cellerna för att producera en primär cellkultur. Trypsin är ett proteinnedbrytningsenzym, och enzymblandningen som används vid trypsinisering kan vara antingen ett råextrakt eller en renad produkt. Råextraktet sägs vara mer effektivt vid proteinlys och cellsönderdelning eftersom det innehåller andra nedbrytande enzymer.
Varm trypsinisering är den vanligaste enzymatiska metoden för cellupplösning som äger rum under högre temperaturförhållanden. Före behandlingen med trypsinering hackas den önskade vävnaden i mindre bitar. Det underlättar den enkla uppdelningsprocessen. Den hackade vävnaden tvättas sedan i ett speciellt medium som kallas Dissection Basal S alt medium.
När tvättsteget har slutförts omvandlas cellerna till en kolv som innehåller det aktiva enzymet, som är trypsin. Eftersom denna teknik innebär ett varmt trypsiniseringsprotokoll, placeras trypsinet vid en temperatur på cirka 37 0C i cirka fyra timmar.
Figur 01: Trypsin
Innehållet blandas och skakas med hjälp av centrifugeringsmetoder för att underlätta protokollet och för att påskynda uppdelningsprocessen. När den rekommenderade tiden har uppnåtts kan cellerna härledas från supernatanten. Cellerna som härrör från supernatanten inkuberas sedan vid en speciell temperatur och tid.
Vad är kall trypsinisering?
Kall trypsinisering är den andra typen av trypsinisering som sker under kalla förhållanden. I denna teknik placeras cellerna som hackas och tvättas i flaskor på is och blötläggs sedan med trypsin. Blötläggningsperioden är mycket längre – cirka 6 – 24 timmar.
Efter avslutad blötläggningsproceduren avlägsnas trypsinet från cellysatet och vävnadsbitarna inkuberas ytterligare vid 37 0C i cirka 20 – 30 minuter. Uppdelningen av cellerna åstadkoms genom upprepad pipettering av vävnadsblandningen. Detta gör att cellerna kan dissociera från membranet och komma till supernatanten. När cellerna väl är i supernatanten inkuberas de och odlas vid önskad temperatur och tidsperiod.
Den kalla trypsiniseringsmetoden har flera fördelar
- Högre utbyte av livskraftiga celler eftersom cellskadorna minimeras. Cellskadorna minimeras genom att inte använda centrifugeringssteg.
- Mycket bekväm metod.
- Mindre mödosamt.
Den huvudsakliga begränsningen med kalltrypsiniseringsmetoden är att stora mängder inte kan användas i en instans.
Vilka är likheterna mellan varm och kall trypsinisering?
- Både varm och kall trypsiniseringsprocesser använder enzymet trypsin för sönderdelning av celler.
- Både varm och kall trypsiniseringsprocesser används i cellodlingsprocedurer för uppdelning av celler.
- I både varm och kall trypsiniseringsbehandling, härleds cellerna från supernatanten.
Vad är skillnaden mellan varm och kall trypsinisering?
Varm vs Kall Trypsinisering |
|
| Varm trypsinisering är metoden för att behandla cellerna med trypsin under varma förhållanden vid en temperatur på 36,5 – 37 0. | Kall trypsinisering är processen för trypsinbehandling som äger rum under kallare förhållanden, helst på is som håller mycket låga temperaturer. |
| Protocol | |
| De hackade vävnadsbitarna hålls vid 37 0C kontinuerligt under hela proceduren. | De hackade vävnadsbitarna hålls initi alt vid iskalla temperaturer och hålls sedan vid 37 0. |
| Temperature | |
| Varm trypsinisering sker vid 36,5 – 37 0 | Kall trypsinisering sker vid iskalla temperaturer. |
| Tidsåtgång | |
| Mindre tid krävs för hela processen (cirka 4 timmar) av varm trypsinisering. | Längre tid krävs (cirka 6 – 24 timmar) för kall trypsinisering. |
| Yield of Viable Cells | |
| Låg i varm trypsinisering. | Hög i kall trypsinisering. |
| Användning av centrifugering | |
| Centrifugering krävs för sönderdelning av celler i varm trypsinisering. | Centrifugering krävs inte vid kall trypsinisering. |
| Initial vävnadskvantitet för trypsinisering | |
| En större mängd vävnad kan användas vid varm trypsinisering. | En mindre mängd vävnad kan användas vid kall trypsinisering. |
| Cellskada | |
| Hög på grund av centrifugering i varm trypsinisering. | Mindre på grund av kall trypsinisering. |
Sammanfattning – varm vs kall trypsinisering
Trypsinisering är metoden för att använda det proteinnedbrytande enzymet trypsin för sönderdelning och beredning av primära cellkulturer under cellodlingsprocessen. Det finns två huvudtekniker för trypsinisering baserat på de temperaturer som används under proceduren. De är varm och kall trypsinisering. Varm trypsinisering utförs vid 37 0C medan kall trypsinisering utförs under iskalla förhållanden. Även om kall trypsinisering tar längre tid för att fullbordas, sägs den ha ett högre utbyte av livskraftiga celler. Detta beror på det faktum att cellskador minimeras vid kall trypsinisering eftersom den inte använder kraftiga centrifugeringssteg. Detta är skillnaden mellan varm och kall trypsinisering.
