nyckelskillnad – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green och Taqman är två metoder som används för att upptäcka eller titta på förstärkningsprocessen av re altids-PCR. SYBR Green är en metod baserad på interkalerande nukleinsyrafärgningsfärg medan Taqman är en metod baserad på hydrolysprob. Båda teknologierna är designade för att generera fluorescens under PCR, vilket gör att re altids-PCR-maskinen kan övervaka reaktionen i "re altid". SYBR Green-metoden utförs med ett fluorescerande färgämne som kallas SYBR green och detekterar amplifieringen genom att binda färgämnet till producerat dubbelsträngat DNA. Taqman utförs med användning av dubbelmärkta prober och detekterar amplifieringen genom nedbrytning av sonden av Taq-polymeras och frisättningar av fluoroforen. Detta är den viktigaste skillnaden mellan SYBR Green och Taqman.
Vad är SYBR Green?
SYBR Green är ett fluorescerande färgämne som används för att färga nukleinsyror, särskilt dubbelsträngat DNA inom molekylärbiologi. SYBR Grön metod används för att kvantifiera PCR-produkter under re altids-PCR. När det väl binder till DNA absorberar det resulterande DNA-färgämneskomplexet blått ljus och avger intensivt grönt ljus. Det händer på grund av den strukturella förändring som sker i färgämnesmolekylen vid bindning med dubbelsträngat DNA. När PCR skapar mer och mer DNA, binder fler färgämnesmolekyler till DNA, vilket genererar mer fluorescens. Därför ökar fluorescensen med PCR-produktackumuleringen. Därför kan mängden PCR-produkt mätas kvantitativt med SYBR Green fluorescensdetektion.
SYBR grönt färgämne kan också användas för DNA-märkning i cytometri och fluorescerande mikroskopi. Etidiumbromid har framgångsrikt ersatts av SYBR Green eftersom etidiumbromid är ett cancerframkallande färgämne med avfallsproblem under DNA-visualisering i gelelektrofores.
Det finns fördelar och nackdelar med SYBRs gröna metod. Denna metod är mycket känslig, billig och lätt att använda. Men på grund av dess förmåga att binda till vilket dubbelsträngat DNA som helst, kan ospecifik bindning leda till överkvantifiering av PCR-produkten.
Figur 01: SYBR Green Technique
Vad är Taqman?
Taqman är en alternativ metod till SYBR Green för att övervaka PCR-processen i re altid. Denna metod beror på 5'-3' exonukleasaktiviteten hos Taq-polymerasenzymet för att bryta ned proberna under förlängningen av den nya strängen och frisättningen av fluorofor. Dubbelmärkta prober används i denna metod och den är baserad på hydrolys av prober. Prober är fluorescensmärkta DNA-oligonukleotider som har en fluorescerande reportermolekyl (fluorofor) vid 5'-änden och en quencher-molekyl vid 3'-änden. De är utformade för att binda till den enkelsträngade mallen på motsatt sida av primerglödgningen. Taq-polymeras lägger till nukleotider till primern och förlänger den nya strängen mot de dubbelmärkta proberna. När Taq-polymeraset möter sonden aktiveras och bryter exonukleasverkan av Taq-polymeraset ned sonden. När den väl har slutfört syntesen av den nya strängen, utsätts sonden för fullständig nedbrytning och frigör fluoroforen. Frisättningen av fluorofor genererar fluorescens. Fluorescerande släckningsmolekyl släcker effektivt det emitterade ljuset och skapar resultatet för kvantifiering av PCR-produkten. Frisättningen av fluoroforer och mängden av PCR-produkterna är proportionella. Därför kan kvantifiering enkelt göras med Taqman-metoden.
Figur 02: Taqman-metoden
Taqman-metoden används i re altids-PCR, kvantifiering av genuttryck, detektion av genetiska polymorfismer, kvantifiering av kromosomala DNA-deletioner, bakteriell identifiering, verifiering av mikroarrayanalys, SNP-genotypning etc.
Vad är skillnaden mellan SYBR green och Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Grön är baserad på DNA-bindande färgämne. | Taqman är beroende av hybridiseringsprober och 5' till 3' exonukleasaktivitet av Taq-polymeras. |
| Fluorescerande märkta sonder | |
| Inga fluorescensmärkta prober krävs inte. | Dubbelmärkta sonder krävs. |
| Multiplex genanalys | |
| Den kan inte användas för multiplexa genmål. | Den kan användas för multiplexa genmål. |
| Kostnad | |
| Detta är billigare. | Detta är dyrare. |
| Specificity | |
| Detta är mindre specifikt och binder med valfritt dubbelsträngat DNA | Dessa är mycket specifika eftersom sonder detekterar de specifika amplifieringsprodukterna. |
| Effektivitet | |
| Detta är mindre effektivt. | Detta är mycket effektivt. |
| Application | |
| Detta används i re altids-PCR, visualisering av agarosgel, DNA-märkning etc. | Detta används i re altids-PCR, kvantifiering av genuttryck, detektion av genetiska polymorfismer, etc. |
Sammanfattning – SYBR Green och Taqman
Taqman och SYBR green är två metoder som används i re altids-PCR (kvantitativ PCR). Båda metoderna möjliggör kvantifiering av PCR-produkten effektivt och förlitar sig på emissionen av fluorescensen. Taqman-metoden använder dubbelmärkta prober för detektion av det ackumulerade DNA:t medan SYBR Green-metoden använder ett fluorescerande färgämne. Båda dessa metoder har också olika tillämpningar inom molekylärbiologi.
