nyckelskillnad – SDS-sida kontra ursprunglig sida
SDS och native page är två typer av polyakrylamidgelelektroforestekniker som används inom molekylärbiologi. Den viktigaste skillnaden mellan SDS Page och Native Page är vilken typ av polyakrylamidgel som används. I SDS Page används en denaturerande gel, därför separeras molekyler baserat på deras molekylvikt. I motsats till Native Page används icke-denaturerande geler. Därför separeras molekyler baserat på deras storlek, laddning och form.
Polyakrylamidgelelektrofores (Page) använder en gel gjord genom att polymerisera akrylamidmonomerer med metylenbisakrylamid. Polyakrylamiden är segare och mer värmestabil än agaros. Polyakrylamidgelerna har en mindre porstorlek som möjliggör effektiv separation av proteiner. Det finns två huvudtyper av sidinställningar, nämligen SDS-sida och ursprunglig sida. SDS Page eller Sodium-Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gelelektrofores separerar proteiner baserat på deras molekylvikter. Denaturerande geler används i SDS-sidan. Native Page använder icke-denaturerande geler och separerar proteiner baserat på deras storlek, laddning och form (3D-konformation).
Vad är SDS-sida?
SDS-sidan är den vanligaste elektroforetiska tekniken som används för att separera proteiner baserat på deras molekylvikt. Gelen görs genom att tillsätta SDS (Sodium dodecyl sulfate), som är ett rengöringsmedel. SDS proteser omvandlar proteiner till monomerer. SDS är ett anjoniskt rengöringsmedel. Därför tillför det en negativ nettoladdning till proteinerna inom ett brett pH-område. När den negativa nettoladdningen tillförs proteinmolekylerna, på grund av laddningsvariationen, bryts de komplexa strukturerna ner. På grund av den negativa laddningen drar proteiner till sig mot den positiva änden. Molekyler med lägre molekylvikt färdas således snabbare på gelmatrisen och kan observeras nära anoden, medan proteiner med högre molekylvikt observeras närmare brunnarna.
Figur 01: SDS-sida
SDS-bindningen till polypeptidkedjan är proportionell mot dess relativa molekylmassa. Därför kan molekylmassan också bestämmas via SDS-sidan. Färgningen av SDS Page-gelerna görs genom bromfenolblåttfärgning. Tillämpningar av SDS-sidor sträcker sig i större utsträckning där det kan användas för att uppskatta den relativa molekylmassan och för att bestämma den relativa mängden proteiner i en proteinblandning. SDS-sidan kan också användas för att bestämma proteinfördelningen i en blandning av proteiner. SDS Page används också för att rena och utvärdera proteiner. Det används som en preliminär procedur för western blotting och hybridisering, som i sin tur används för proteinkartläggning och identifiering.
Vad är ursprunglig sida?
Native polyakrylamidgelelektrofores (Native Page) använder en icke-denaturerande gel. Därför tillsätts inte SDS eller något annat denaturerande medel till gelmatrisen. I Native Page är separationen av proteiner baserad på laddningen och storleken på proteinet. Därför beror proteinets rörlighet på laddningen och storleken på proteinet.
Proteinets laddning beror på aminosyrornas sidokedjor. Om sidokedjorna är negativt laddade kommer proteinet att få en övergripande negativ laddning och vice versa. Proteiner behåller en 3D-konformation på grund av veckningen som äger rum. Vikning är resultatet av de olika bindningstyperna i proteiner såsom disulfidbindningar, hydrofoba interaktioner och vätebindningar. Därför, om den ursprungliga sidan bärs vid ett neutr alt pH, kommer proteinerna att separeras enligt proteinets molekylära form. Därför kan Native Page användas som en känslig teknik för att upptäcka förändringar i laddning eller konformation av proteinet.
Den största fördelen med native Page är att proteinet som används för Page-analysen kan återvinnas i sitt ursprungliga tillstånd efter Page-analysen, eftersom proteinet inte störs under processen. Native Page är en teknik med relativt hög genomströmning och proteinets stabilitet ökar.
Figur 02: Inbyggd sida
När gelkörningen är klar kan Native Page-gelen ses genom att färgas med bromfenolblått eller något annat lämpligt färgningsreagens. Tillämpningarna av Native Page inkluderar separation av sura proteiner inklusive glykoproteiner såsom humant rekombinant erytropoietin eller identifiering av proteiner som finns i bovint serumalbumin (BSA).
Vilka är likheterna mellan SDS-sida och ursprunglig sida?
- Både SDS Page- och Native Page-systemen använder polyakrylamidgel som gelens matris.
- Båda används för separation och identifiering av proteiner.
- Båda använder elektroforetisk rörlighet för att separera föreningarna.
- Båda kan göras vertik alt eller horisontellt (mest gjort som vertikala sidinställningar eftersom körlängden är längre).
- Elektroforesapparaten inklusive geltanken, kammar, strömförsörjning krävs för driften av båda teknikerna.
- Visualiseringen av gelén kan göras genom färgningsmetoder i båda teknikerna.
Vad är skillnaden mellan SDS-sida och ursprunglig sida?
SDS-sida kontra ursprunglig sida |
|
| SDS Page eller Sodium-dodecyl sulfate Page separerar proteiner baserat på deras molekylvikt, och den använder en denaturerande gel. | Native Page använder icke-denaturerande geler och separerar proteiner baserat på deras storlek, laddning och form (3D-konformation). |
| Typ av gel | |
| En denaturerande gel används i SDS-sidan. | En icke-denaturerande gel används på den ursprungliga sidan. |
| Närvaro av SDS | |
| SDS finns som ett rengöringsmedel för att ge en negativ laddning på provet på SDS-sidan. | SDS finns inte på den inbyggda sidan. |
| Separationsbas | |
| Separation av proteiner beror på proteinets molekylvikt på SDS-sidan. | Separation beror på storleken och formen på proteinmolekylen på den ursprungliga sidan. |
| Proteinets stabilitet | |
| Proteinets stabilitet är låg på SDS-sidan. | Proteinets stabilitet är hög på den ursprungliga sidan. |
| Återvinning av det ursprungliga proteinet | |
| Inte möjligt eftersom det är denaturerat på SDS-sidan. | Möjligt på den ursprungliga sidan. |
Sammanfattning – SDS-sida kontra ursprunglig sida
SDS Page och Native Page är två typer av polyakrylamidgelelektroforestekniker som används för att separera proteiner. SDS Page behandlas med ett rengöringsmedel som kallas SDS. SDS ger en övergripande negativ laddning till proteinet, vilket sedan resulterar i denaturering av proteinet. Därför separeras proteinerna baserat på deras molekylvikt. Däremot använder Native Page-tekniken inget denatureringsmedel. Således separeras proteinerna antingen baserat på deras storlek eller form. Detta är skillnaden mellan SDS-sida och inbyggd sida.
